Ana səhifə

The Prostate Regulation of Androgen Receptor Expression by


Yüklə 480.06 Kb.
tarix09.05.2016
ölçüsü480.06 Kb.
The Prostate
Regulation of Androgen Receptor Expression by

Z-Isochaihulactone Mediated by the JNK Signaling Pathway

and Might Be Related to Cytotoxicity in Prostate Cancer
Po-Yen Liu,1 Shinn-Zong Lin,2 Jim Jinn-Chyuan Sheu,3,4 Cheng-Tung Lin,5 Po-Cheng Lin,6

Yi-Wen Chou,7 Mao-Hsuan Huang,8 Tzyy-Wen Chiou,9 and Horng-Jyh Harn10*



1Graduate Institute of Chinese Medicine,China Medical University,Taichung,Taiwan

2Center for Neuropsychiatry,China Medical Universityand Hospitaland Beigang Hospital,

Taichung,Taiwan



3Human Genetic Center,China Medical University Hospital,Taichung,Taiwan

4Schoolof Chinese Medicine,China Medical University,Taichung,Taiwan

5Department of Chemistry,Tung Hai University,Taichung,Taiwan

6Research and Development Department,Gwo Xi Stem Cell Applied Technology, Hsinchu,Taiwan

7Center for Neuropsychiatry,China Medical University Hospital,Taichung,Taiwan

8Department of Life Sciences, National Chung Hsing University,Taichung,Taiwan

9Department of Life Science and Graduate Institute of Biotechnology, National Dong Hwa University,

Hualien,Taiwan



10Department of Pathology,China Medical University Hospital,Taichung,Taiwan

BACKGROUND. The androgen receptor (AR) is a main therapeutic target for treatment of

prostate cancer (PCa). The natural compound isochaihulactone (K8), which has a chiral center

ring and two racemic forms (E-K8 and Z-K8), has anti-tumor effects on multiple cancer

types both in vitro and in vivo. Here, we determined which form of K8 contains significant

tumor cytotoxicity and examined how this form regulates AR expression in PCa cells and

xenografts.

METHODS. We chose the androgen-dependent human PCa cell line LNCaP and the andro-

gen-independent cell lines DU145 and PC-3 to study the anti-tumor potency and AR regula-

tion mediated by Z-K8. We measured cell viability and used flow cytometry, RT-PCR, and

Western blotting. Growth inhibition in vivo was evaluated with an LNCaP xenograft animal

model.


RESULTS. In LNCaP cells, Z-K8 significantly repressed cell proliferation, induced apopto-

sis, repressed AR mRNA and protein expression in a time-dependent manner, and induced

JNK phosphorylation. Furthermore, treatment with a JNK inhibitor significantly abolished

Z-K8-induced AR downregulation. Z-K8 did not significantly inhibit reporter gene expres-

sion of constructs containing the AR promoter when it contained a mutated Sp1 binding site.

Z-K8 also showed anti-tumor effects in the xenograft animal model.


Grant sponsor: National Science Council of the Republic of China;

Grant number: NSC 99-2628-B-039-004-MY3.

Po-Yen Liu and Shinn-Zong Lin contributed equally to this work.

Horng-Jyh Harn and Tzyy-Wen Chiou contributed equally to this

work.

Conflict of interest: None.



ß 2012 Wiley Periodicals,Inc.

*Correspondence to: Horng-Jyh Harn, Department of Pathology,

China Medical University Hospital, No. 2, Yude Road, Taichung,

Taiwan. E-mail: duke_harn@yahoo.com.tw

Received 6 April 2012; Accepted 30 August 2012

DOI 10.1002/pros.22593

Published online in Wiley Online Library

(wileyonlinelibrary.com).



2 Liu et al.


CONCLUSION. Z-K8 not only induced LNCaP apoptosis but also reduced AR

expression. These results indicate that Z-K8 may be a potential anti-tumor drug for PCa

therapy. Prostate # 2012 Wiley Periodicals, Inc.

KEY WORDS: prostate cancer; Z-K8; androgen receptor; JNK pathway




INTRODUCTION

Prostate cancer (PCa) is the most common malig-

nancy diagnosed in American males [1]. Detection

and treatment of the disease is highly successful

when tumors are confined to the prostate and when

their growth and survival are strongly androgen

dependent. Therefore, it is important to better under-

stand the molecular events associated with the devel-

opment of androgen-independent and/or metastatic

PCa to develop more effective therapeutics. The pros-

tate gland depends on circulating androgens for prop-

er cellular proliferation, differentiation, and survival.

Several recent publications suggest that downregula-

tion of androgen receptor (AR) expression should be

considered the main strategy for the treatment of an-

drogen-independent PCa [2–4].

Nan-Chai-Hu (Chai Hu of the South), the root of

Bupleurum scorzonerifolium, is an important Chinese

herb used in the treatment of influenza, fever, malar-

ia, cancer, and menstrual disorders in China and

Japan. We previously reported that a crude acetone

extract of B. scorzonerifolium causes cell cycle arrest of

lung adenocarcinoma A549 cells in the G2/M phase,

leading to the formation of giant cells and apoptosis

[5,6]. We further fractionated the acetone extract and

identified a novel lignan, isochaihulactone (K8),

which has anti-tumor activity against A549 cells in

vitro and in vivo [7]. These findings indicate that K8

is a promising new anti-mitotic anti-cancer com-

pound with potential for clinical applications.

Some epidemiological reports suggest that Asian

men are less susceptible to benign prostate hyperpla-

sia and PCa than European and American men. This

may be due to the Asian diet, which contains high

amounts of phytoestrogens [8,9]. Phytoestrogens are

widely distributed in plants and mainly fall into three

categories: isoflavones, lignans, and flavonoids. Sev-

eral studies have provided evidence that lignans from

Camissoniopsis hirtella, a major subtype of phytoestro-

gens, can suppress AR function and signaling [9]. The

structure of K8 was determined and was shown to be

a lignan [7]. K8 has a chiral-ring center and two race-

mic forms (the E and Z forms). We have isolated the E

and Z forms to determine which form has anti-tumor

effects on PCa. As described here, the Z form showed

in vitro and in vivo tumor cytotoxicity that was more

potent than that of the E form. In addition, Z-K8
The Prostate

suppressed AR expression and transcriptional activity

in LNCaP cells.
MATERIALS ANDMETHODS

Reagents and Compounds

Testosterone was obtained from Sigma Chemical

Co. (St. Louis, MO). 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma) was dis-

solved in phosphate-buffered saline (PBS) to a con-

centration of 5 mg/ml and stored at 48C. AR and

Ki67 antibodies were purchased from Santa Cruz Bio-

technology (Santa Cruz, CA), and JNK, phospho (p)-

JNK, Akt, p-Akt, protein kinase C (PKC), p-PKC, and

cleaved caspase-3 antibodies were purchased from

Cell Signaling (Beverly, MA). Polyvinyldifluoride

membranes, bovine serum albumin protein assay kit,

and Western blot chemiluminescence reagent were

purchased from Amersham Biosciences (Arlington

Heights, IL). The JNK-specific inhibitor SP600125 was

purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN).

Purification of Z-form K8 and E-form K8 was carried

out with flash chromatography using silica gel 60

(230–400 mesh; Merck; Whitehouse Station, NJ) and

confirmed with nuclear magnetic resonance.
Cell Lines and Culture

The LNCaP (androgen dependent), DU145 (andro-

gen independent), and PC-3 (androgen independent)

cell lines were obtained from the Bioresources Collec-

tion and Research Center (Hsin Chu, Taiwan). Cells

were cultured in RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT)

supplemented with 0.22% sodium bicarbonate,

0.011% sodium pyruvate (HyClone), 0.45% glucose,

0.24% HEPES (HyClone), 10% fetal bovine serum

(FBS; HyClone), and 100 ng/ml each penicillin and

streptomycin (HyClone) at 378C in a humidified

atmosphere with 5% CO2.


Growth Inhibition Assay

The viability of the cells after treatment with vari-

ous chemicals was evaluated using the MTT assay

and was performed in triplicate [10]. Briefly, the can-

cer cells (5 Â 103) were incubated in 96-well plates

containing 200 ml culture medium. Cells were permit-

ted to adhere for 12–18 hr and then washed with PBS.



Solutions were always prepared fresh by dissolving

0.2% dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma) or Z-K8 in

culture medium. Cells were exposed to Z-K8 for

48 hr, washed with PBS, and fresh medium was

added. The cells in each well were then incubated in

500 mg/ml MTT in culture medium for 4 hr. After

the medium was removed, 200 ml DMSO and 25 ml

glycine buffer (0.1 M glycine, 0.1 M NaCl, pH 10.5)

were added to each well. Absorbance at 570 nm was

detected with a PowerWave X Microplate ELISA

Reader (Bio-TeK Instruments, Winooski, VT). The ab-

sorbance of DMSO-treated cells was considered 100%.

The results were calculated from three independent

experiments.


RNAExtraction and RT-PCR

RT-PCR was used to analyze mRNA expression.

Total RNA was extracted and purified using the

RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA quality

was confirmed by electrophoresis. The concentration

of total RNA was measured with a DU800 spectro-

photometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA). cDNA

was synthesized by reverse transcription of 2 mg total

RNA using oligo (dT)12–18 and SuperScript II RNA

reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). The

cDNA was then used as the template to amplify the

corresponding DNA fragments with PCR using two

sets of synthetic oligonucleotide primers. PCR was

performed with an initial denaturation step of 958C

for 10 min, followed by 35 cycles of denaturing at

958C for 1 min, annealing at 608C for 1 min, and ex-

tension at 728C for 2 min. Primers used for AR PCR

amplification were (F) 50-ATGGTGAGCAGAGTG

CCCTA-30 and (R) 50-GTGGTGCTGGAAGCCTCT-

CCT-30; for prostate-specific antigen (PSA) were (F)

50-GGTGACCAAGTTCATGCTGTG-30 and (R) 50-GT-

GTCCTTGATCCACTTCCG-30; for GAPDH were (F)

50-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-30 and

(R) 50-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-30. The

PCR products were analyzed with electrophoresis

on a 2% agarose gel (MDBio, Taipei, Taiwan). The

intensity of the resulting bands was analyzed with a

GS-800 Calibrated Imaging Densitometer (Quantity

One 4.0.3 software; Bio-Rad, Hercules, CA).
Cell Cycle Analysis

The cell cycle was examined with flow cytometry

and DNA staining to reveal the total amount of DNA.

Approximately 5 Â 105 LNCaP cells were incubated

in various concentrations of Z-K8 for the indicated

times. Cells were harvested with trypsin/EDTA, col-

lected, washed with PBS, fixed with cold 70% ethanol

overnight, and then stained with a solution contain-

ing 45 mg/ml propidium iodide, 10 mg/ml RNase A,

Regulation of AR Expression by Z-Isochaihulactone   3
and 0.1% (w/v) Triton X-100 for 1 hr in the dark. The

cells were then passed through a FACScan flow

cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) to measure

the DNA content. The data were obtained and ana-

lyzed with Cell Quest 3.0.1 (Becton Dickinson, Frank-

lin Lakes, NJ).


Measurement of Caspase-3 and Caspase-9

Activity to Detect Apoptosis

Caspase-3 and caspase-9 activity was measured

with a luminescence assay according to the manufac-

turer’s protocol (Caspase-Glo Assay System; Prom-

ega, Madison, WI). Briefly, 50 ml Caspase-Glo buffer

was added to 50 ml cell lysate supernatants in a 96-

well plate and incubated at room temperature for

60 min. Luminescence was measured using a Biotek

synergy microplate reader (Bio-TeK Instruments).

Background activity levels from homogenization buff-

er only were measured and subtracted from the val-

ues in the cell lysate supernatants. All values were

normalized to the total protein amount. Standard

curves were used to determine the linearity of the

responses.


Western Blot Analysis

LNCaP cells were harvested and lysed with the

PRO-PREPTM protein extraction solution (INtRON,

Sangdaewon Joongwon Seongnam Kyunggi, Korea)

according to the manufacturer’s instructions. Protein

in the cell lysates was quantified using the bicincho-

ninic acid method according to the manufacturer’s

instructions (Thermo Scientific, Barrington, IL). Pro-

tein samples (50 mg) were separated with 10% sodium

dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis,

transferred to a polyvinyldifluoride membrane, and

blocked with 5% nonfat milk at room temperature for

1 hr. Proteins were detected with primary antibodies

against AR, p-JNK, JNK, p-Akt, Akt, p-PKC, PKC,

and b-actin for 1 hr at room temperature, followed by

horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse or

anti-rabbit secondary antibody. The bound antibody

was visualized using an enhanced chemilumines-

cence system (Western Lightning Plus; PerkinElmer

Life Sciences, Waltham, MA).


Construction of Plasmids

The human AR promoter sequence was isolated

using a DNA extraction kit according to the manufac-

turer’s protocol (Qiagen) from volunteer blood. We

mutated the Sp1 binding site in the AR promoter

using a Spl-mut2 primer [11]. Site-specific mutations

were confirmed with DNA sequencing.
The Prostate

4 Liu et al.


Transfection and the Luciferase Reporter System

LNCaP cells were plated in 6-well plates at

2 Â 105 cells/well in RPMI 1640 medium supple-

mented with 10% FBS. After growth overnight, plas-

mid mixtures containing 4 mg AR promoter linked to

luciferase and 0.4 mg pRL-TK (Promega) were trans-

fected with TurboFect transfection reagent (Thermo,

Glen Burnie, MD). After 40 hr of transfection, the cells

were harvested in 1 luciferase lysis buffer, and lucif-

erase activity was determined and normalized to

the pRL-TK luciferase activity with a dual luciferase

assay kit (Promega). The cells were treated with or

without 8 mM Z-K8 in the absence of serum for 24 hr

and then assayed for luciferase activity.


GFP Expression in LNCaP Cells

To create tumor cells that stably express GFP, the

GFP expression construct (TLC-rGFP) was purchased

and verified from Vectorite Biomedica, Inc. (Taipei,

Taiwan). LNCaP cells were plated in 6-well plates at

2 Â 105 cells/well in RPMI 1640 medium supple-

mented with 10% FBS. After growth overnight, cells

were transfected with purified TLC-rGFP plasmid,

which harbors a recombinant GFP fragment. Trans-

fection was performed according to the protocol

included with the TurboFect transfection reagent

(Thermo). Cells with the most intense fluorescence

signal (>95th percentile) were repeatedly sorted via

fluorescence-activated cell separation (BD Biosciences).


The Cytotoxic Effect of Z-K8 in Xenografted Mice

Implantation of LNCaP cells was performed as de-

scribed [7]. Male congenital athymic BALB/c nude

(nu/nu) mice were purchased from the National Sci-

ences Council (Taipei, Taiwan), and all procedures

were performed in compliance with the standard op-

erating procedures of the Laboratory Animal Center

of China Medical University (Taichung, Taiwan). All

experiments were carried out using 6- to 8-week-old

mice weighing 18–22 g. The animals were subcutane-

ously implanted with 1 Â 107 cells in their backs.

When the tumors reached 80–120 mm3, animals were

divided randomly into control and test groups con-

sisting of six mice per group. Daily subcutaneous ad-

ministration of Z-K8 dissolved in a vehicle of 20% (v/

v) Tween 80 in normal saline was performed for

5 days, far from the cell implantation site (>1.5 cm).

The control group was treated with vehicle only. The

mice were weighed three times a week for up to

21 days to monitor the effects, and the tumor volume

was determined by measuring the length (L) and

width (W) of the tumor at the same time. The tumor

volume at day n (TVn) was calculated as TV
The Prostate

(mm3) ¼ (L Â W2)/2. The relative tumor volume at

day n (RTVn) versus day 1 (starting volume) was

expressed according to the following formula:

RTVn ¼ TVn/TV1. To image tumors that developed

in GFP-transfected LNCaP-xenografted mice, the ani-

mals were subcutaneously implanted with 1 Â 107

GFP-transfected LNCaP cells in their backs. The treat-

ment procedure was based on the preceding method.

In vivo bioluminescence imaging was performed

using an IVIS imaging system (200 series, Xenogen

Corp., Alameda, CA). Images were processed using

Living Image1 software (Caliper Life Sciences, Hop-

kinton, MA). All animals in the treated and control

groups were sacrificed when tumors reached a preset

endpoint volume of 1,000 mm3.


Immunohistochemical Staining

All tumor tissues (subcutaneous LNCaP tumors

with or without Z-K8 treatment) were harvested and

fixed. Paraffin-embedded sections were obtained

from the tumors and processed for immunohisto-

chemical staining. Antibodies were incubated with

the resulting sections overnight at 48C. The immune

complexes were visualized using horseradish peroxi-

dase-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary anti-

bodies (Santa Cruz Biotechnology) and the LSAB2

system (DAKO Corp., Carpinteria, CA). Sections were

then incubated for 10 min with 0.5 mg/ml diamino-

benzidine and 0.03% (v/v) H2O2 in PBS. Finally,

sections were counterstained with hematoxylin,

mounted, observed under a light microscope at a

magnification of 400Â, and photographed.


Statistical Analysis

The data are shown as the mean Æ standard devia-

tion (SD). Statistical differences were analyzed using

the Student’s t-test for normally distributed values

and the nonparametric Mann–Whitney t-test for val-

ues with non-normal distribution. Values of P < 0.05

were considered significant.
RESULTS

Z-K8 Is the Major Compound

That Induces Anti-Proliferation Effects

To examine the anti-proliferative effects of K8 on

PCa, we compared the inhibitory effects of E-K8 and

Z-K8 on androgen-dependent (LNCaP) and andro-

gen-independent (PC-3 and DU145) PCa cell lines.

In the MTT assay, the anti-tumor effect of Z-K8 was

significantly stronger (IC50 ¼ 1 mM) than the effect

of E-K8 (IC50 ¼ 58 mM) on LNCaP cells (Fig. 1). The

viability of PC-3 and DU145 cells was similarly more

Fig. 1. Chemical structures of the Z and E isomers of isochaihu-

lactone and the IC50 values for various PCa cell lines.The red boxes

indicate theregion thatdiffersbetween theisomers.

effectively inhibited by Z-K8 in comparison with

E-K8. Next, cells were treated with K8 or different

concentrations of Z-K8 ranging from 6.25 to 50 mM

for 48 hr. Z-K8 was significantly more effective

(IC50 ¼ 1 mM) than K8 in inhibiting the cell viability

of LNCaP cells (IC50 > 20 mM; Fig. 2A). Compared

with its effect on LNCaP cells, Z-K8 inhibited the

growth of androgen-independent (PC-3 and DU145)

cell lines to a lesser extent (Fig. 2B,C). We also exam-

ined the growth inhibition of Z-K8 on LNCaP cells

treated with different concentrations for 24, 48, and

72 hr (Fig. 2D). Overall, Z-K8 inhibited the viability of

LNCaP cells in a dose- and time-dependent manner.

To determine whether Z-K8 also downregulates

LNCaP cell growth in response to androgen stimula-

tion, we used androgens to induce androgen-sensitive

LNCaP cell proliferation. LNCaP cells were grown

in the presence or absence of 25 nM testosterone and

different concentrations of Z-K8 for 48 hr. The growth

of LNCaP cells increased by 36% in the presence

of testosterone as compared with that of cells in the

absence of testosterone (Fig. 2E). Z-K8 efficiently

inhibited testosterone-stimulated LNCaP cell prolife-

ration in a dose-dependent manner (Fig. 2E).
Z-K8 Inhibits the Growth of LNCaP Cells

and Induces Apoptosis

Isochaihulactone can cause cell cycle arrest at the

G2/M phase by increasing p53 and p21 proteins in

LNCaP cells [12]. We carried out assays to examine

the effect of Z-K8 in inducing G2/M-phase arrest

and apoptosis in LNCaP cells. Cells were treated with

different concentrations of Z-K8 (1 and 2 mM) for



Regulation of AR Expression by Z-Isochaihulactone   5
24 hr. The percentage of cells in the G2/M phase

increased from 19.9% in the control population

to 45.1% and 60.2% at concentrations of 1 and 2 mM

Z-K8, respectively (Fig. 3A). Thus, Z-K8 increased

tumor apoptosis (as indicated by cells in the sub-G1

phase, which represents cell apoptosis) and G2/M

arrest in a dose-dependent manner.

In general, the activity of drugs that induce tumor

apoptosis is mediated by activated caspase-3 and cas-

pase-9 [13], and thus we investigated the involvement

of these two caspases in Z-K8–induced apoptosis

in LNCaP cells. Caspase-9 and caspase-3 were both

activated in a concentration-dependent manner after

addition of Z-K8 (0.5–2 mM) to LNCaP cells (Fig. 3B).

These results suggest that decreased LNCaP cell via-

bility as a result of Z-K8 treatment may be associated

with G2/M-phase arrest and apoptosis.
Z-K8 Suppresses AR Expression and

Transcriptional Activity in LNCaP Cells

Because Z-K8 showed strong inhibition of LNCaP

cell viability (Fig. 2A) and because several previous

studies have indicated that AR downregulation

results in significant cell growth inhibition and in-

creased apoptosis [14–16], we determined if Z-K8

affects AR expression and transcriptional function in

LNCaP cells. First, we examined whether Z-K8 inhib-

ited the expression of PSA, an AR response gene, and

a clinical diagnostic marker for PCa. To further inves-

tigate whether Z-K8 altered cellular levels of AR,

LNCaP cells were treated with various concentrations

of Z-K8. Z-K8 significantly decreased PSA and AR

protein expression in a dose-dependent manner

(Fig. 4A). We observed downregulation of cellular AR

expression at both the mRNA and protein levels in

a time-dependent manner (Fig. 4B,C). This further

suggested that Z-K8 not only affected the expression

of AR protein but also inhibited its transcriptional

activity.
Requirement for JNK Pathway Induction for

Attenuation of AR Expression and Activity

To explore the mechanisms involved in the attenu-

ation of AR expression by Z-K8, we examined regula-

tion of the mitogen-activated protein kinase signaling

pathways, which include the Akt and PKC sub-

groups, after treatment of LNCaP cells with Z-K8.

The phosphorylation level of JNK was increased after

treatment of LNCaP cells with Z-K8 (Fig. 5A). Phos-

phorylation of p38 and ERK1/2 was not detected in

treated LNCaP cells (data not shown). Next, the

effects of the JNK inhibitor SP600125 on AR expres-

sion and function were examined. The level of p-JNK

was blocked by SP600125 treatment (Fig. 5B), and


The Prostate

6 Liu et al.


Fig. 2. Z-K8 inhibits the growth of DU145, PC-3, and LNCaP cells. Cells were treated with different concentrations of K8 and Z-K8

(6.25^50 mM) for 48 hr. The effect of K8 and Z-K8 on the growth of the human PCa cell lines (A) LNCaP, (B) PC-3, and (C) DU145 cells.

D: LNCaP cells were treated with differentconcentrations of Z-K8 for 24, 48, and 72 hr.The data represent the mean Æ SD from three inde-

pendent experiments. ÃP < 0.05, ÃÃP < 0.01, ÃÃÃP < 0.001. E: LNCaP cells were treated with vehicle (DMSO) or various concentrations

(0, 0.625,1.25, 2.5, 5, and10 mM) of Z-K8 in the presence (þ) or absence (À) of 25 nM testosterone (T) for 48 hr. #P < 0.05 compared with no

testosterone; ÃP < 0.05, ÃÃP < 0.01, ÃÃÃP < 0.001, comparedwithcellsin thepresence of testosterone.


pretreatment with SP600125 partially reversed the

Z-K8-mediated downregulation of AR expression

(Fig. 5C). Our results suggest that JNK activation may

be involved in suppression of AR by Z-K8.

Because Sp1 binding is a major regulator of AR ex-

pression [11], we examined whether induction of JNK

by Z-K8 is linked directly to Sp1, which subsequently

affects AR expression. To assess the transcriptional ac-

tivity of the AR promoter, its activity was evaluated

in LNCaP cells after transient transfection of a


The Prostate

luciferase reporter construct that contained either the

wild-type full-length AR promoter or a mutant AR

promoter (Fig. 5D) that contained a mutated Sp1

binding site that is incapable of binding Sp1 (Spl-

mut2) [11]. Introduction of the wild-type AR promot-

er affected luciferase transcription (Fig. 5E), but

the promoter containing the mutant Sp1 site had

a smaller effect. These results suggest that Sp1 may

play an important role in Z-K8-mediated AR

downregulation.

Regulation of AR Expression by Z-Isochaihulactone 7


Fig. 3. Effect of Z-K8 on cell cycle distribution and markers of apoptosis in LNCaP cells. A: LNCaP cells cultured with vehicle (DMSO) or

Z-K8 (1and 2 mM) for 24 hr were fixed, stained with propidium iodide, and analyzed with fluorescence-activated cell sorting.The percentage

of the cell population in each stage is shown.Values are the mean Æ SD (n ¼ 3). B: Z-K8 increased the activity of caspase-3 and caspase-9 in

LNCaP cells, leading to tumor cell apoptosis. Cells were treated with vehicle (DMSO) or different concentrations of Z-K8 (0.5^2 mM) for

48 hr.The data represent themean Æ SD from threeindependentexperiments (n ¼ 3). ÃÃP < 0.01, ÃÃÃP < 0.001.


Z-K8 InhibitsTumor Growth in an

LNCaPXenograft Model

We examined the inhibition by Z-K8 of human

xenografts grown in mice. Briefly, LNCaP tumor-

bearing mice were subcutaneously administered vehi-

cle control, 15 mg/kg Z-K8, or 30 mg/kg Z-K8 for

five consecutive days. The volumes of the tumors

were measured every 3 days until day 21. Tumor

volumes in vivo were evaluated by assessing GFP ex-

pression using optical fluorescence imaging of LNCaP

xenograft tumors (Fig. 6A). We did not observe toxic

effects of Z-K8 at the administered doses, as evi-

denced by the absence of changes in body weight

(Fig. 6B), but treatment with either dose significantly

inhibited tumor growth (Fig. 6C). Immunohistochem-

ical staining with an AR-specific antibody also

revealed that the expression of AR in the tumors of

mice treated with 30 mg/kg Z-K8 was weaker than

that in control tumor sections (Fig. 6D). Interestingly,

Z-K8 downregulated AR and Ki67 expression but

upregulated cleaved caspase-3 (Fig. 6D). These obser-

vations suggest that Z-K8 inhibits tumor growth and

downregulates AR protein levels in vivo.
DISCUSSION

We previously reported that K8 has an inhibitory

effect on PCa by upregulating NAG-1 via JNK activa-

tion in LNCaP cells [12]. We isolated the structure of

K8 and determined the existence of two racemic

forms (the E and Z forms). To determine which form

has the anti-tumor effect, the E and Z forms were syn-

thesized. The Z form showed more significant tumor

cytotoxicity than that of the E form in vitro (data not

shown). In this study, Z-K8 had a greater antiprolifer-

ative effect on androgen- responsive cells (LNCaP)

than on cells lacking AR (PC-3 and DU145; Fig. 2A–


The Prostate

8 Liu et al.


Fig. 4. Effect of Z-K8 on AR-mediated gene expression and AR protein expression. A: Decrease in AR and PSA protein expression in

LNCaPcells.Cells were treatedwithvarious concentrations (0,1, 2,4, and 8 mM) of Z-K8 for 48 hr.B:Decreasein AR and PSA RNA expression

in LNCaP cells. After incubation with 8 mMZ-K8 for various times, cells were collected, total RNAwas isolated, and RT-PCRwas performed.

GAPDH was used as aninternal control.C:LNCaPcells were treated with 8 mMZ-K8 for various times. ARprotein levels were evaluated with

Westernblotting. b-actinwasused as aninternalcontrol.


C). The growth inhibitory effect of Z-K8 on LNCaP

cells was greatest when the medium contained andro-

gens (Fig. 2E). These results demonstrate that andro-

gen/AR signaling plays a role in the Z-K8–mediated

inhibition of cell growth. There are several differences

among LNCaP, DU145, and PC-3 cells that may

account for this difference in sensitivity. LNCaP, a

much less aggressive cell line, expresses wild-type

p53 and AR. PC-3 is a more aggressive cell line and is

null for p53 and AR. DU145 is also a more aggressive

cell line that expresses a mutated p53 and is null for

AR. In our previous study, we showed that K8 causes

cell cycle arrest at the G2/M phase, which was corre-

lated with an increase in p53 and p21 levels and

downregulation of the checkpoint proteins cdc25c, cy-

clin B1, and cdc2 in LNCaP cells [12]. In our current

study, we confirmed that Z-K8 mediated LNCaP cell

cycle arrest at the G2/M phase.

In addition, Z-K8 significantly inhibited LNCaP

growth, possibly by inducing apoptosis. We showed

that Z-K8 at concentrations as low as 1 mM inhibited

LNCaP cell viability. Z-K8 at concentrations of 2–

8 mM demonstrated optimal inhibitory effects on AR

expression and function. Therefore, a relatively high

concentration of Z-K8 (8 mM) was used in subsequent

experiments. These results are consistent with the


The Prostate

recently established observation that AR downregula-

tion results in PCa cell growth inhibition [17]. The

reduction in AR levels caused by Z-K8 may involve

a transcriptional or a posttranslational mechanism.

However, the degree of degradation of AR protein

and mRNA in LNCaP cells treated with Z-K8

(Fig. 4A,B) leads us to hypothesize that a transcrip-

tional mechanism is the major mechanism in Z-K8-

mediated AR downregulation.

The focus of tumor marker research in PCa is now

on altered genes, particularly those involved in AR

signaling. We determined the expression of the an-

drogen-regulated gene PSA, which is a marker that is

widely used for detecting PCa [18]. In this study, we

found that a lignan from B. scorzonerifolium, K8,

downregulated cellular PSA and AR expression in

LNCaP cells (Fig. 4A,B). In a previous study, two

lignans from Campylotropis hirtella (Franch.) inhibited

PSA and AR expression [9]. Both lignans have a ben-

zotetrahydrofuran element, which is similar to testos-

terone. This similarity may play an important role

in AR inhibition and may be why Z-K8, which has

a similar benzo(d)-1,3-dioxolane unit affects AR

expression.

Z-K8-mediated repression of AR expression and

activity was partially reversed by blocking the JNK

Regulation of AR Expression by Z-Isochaihulactone 9


Fig. 5.  Signaling pathways involved in Z-K8 ^mediated AR repression. A: LNCaP cells were treated with Z-K8 for 0 ^360 min.

Western blot analysis was performed for p-JNK, JNK, p-Akt, Akt, p-PKC, and PKC. b-actin was used as an internal control. B: LNCaP cells

were pre-treated with the JNK inhibitor SP600125 (5, 10, 20, or 40 mM) for 1 hr. Western blot analysis was performed for p-JNK. b-actin

was used as an internal control.C: LNCaP cells were pretreated with the JNK inhibitor SP600125 and then treated with 8 mM Z-K8 for 48 hr.

Western blot analysis was performed for AR. b-actin was used as an internal control.D: Comparison of the wild-type and mutant sequence

between À63 and À5 in the AR promoter region.Mutatedbases areindicatedwithlowercaseletters.E:Wild-type AR (À63 to À5) or ARwith a

mutated Sp1binding site (Sp1-mut2) was fused to a luciferase reporter gene and co-transfected into LNCaP cells with pRL-TK. After a 40 -hr



transfection, cells were treatedwithvehicle (DMSO) or 8 mMZ-K8 for 24 hr, lysed, and analyzedfor luciferase activity.Luciferase activity was

normalized to Renilla luciferase (pRL-TKvector) to control for the transfection efficiency.The results are the mean Æ SD from three separate

transfections. ÃÃP < 0.01.


signaling pathway. Furthermore, an increase in the

c-Jun protein level has a dominant inhibitory effect on

the enhancing function of Sp1 on androgen-regulated

reporter activities [19]. Previously, EGCG, a green tea

polyphenol, was shown to downregulate protein lev-

els of Sp1, which affects the expression and function

of AR [20]. The AR promoter harbors a GC box do-

main that is the binding site for Sp1, which is the ma-

jor factor in the regulation of basal expression of AR

[21]. The present work is part of a study that focuses

on the identification of elements involved in Z-K8 reg-

ulation of expression of AR mRNA. The Sp1 binding


The Prostate

10 Liu et al.


Fig. 6. In situ expression of tumor growth in vivo.LNCaP tumor-bearing mice (tumor size, $100 mm3) were subcutaneously administered

withvehicle control,15 mg/kg Z-K8, or 30 mg/kg Z-K8 for 5 days and thenweremonitoreduntilday 21.A: GFPexpressionin LNCaP xenograft



tumors from representative mice. Color scale bar indicates fluorescence intensity in photons/sec. B: The body weights of mice (n ¼ 6 per

group) were not significantly different after Z-K8 treatment. Body weights are presented as the mean Æ SD.C: The relative tumor volume

was significantly different between the Z-K8 -treated groups and the control group. Tumor size is shown as the mean Æ SD. ÃÃP < 0.01.

D: Immunohistochemical staining was performed in LNCaP tumor tissues. After treatment for 5 days, sections from vehicle control and



Z-K8 -treatedmicewere stainedwith anti-AR, anti-Ki67, and anti-cleavedcaspase-3. Scalebar ¼ 20 mm.

The Prostate





sequence at À46/À37 in the human AR promoter

plays a central role in transcription initiation [11]. In

this study, Z-K8 did not significantly inhibit expres-

sion of a reporter gene containing mutated Sp1

sequences (Fig. 5E). These results indicate that in the

wild-type Sp1-containing promoter, Z-K8 likely

affects the Sp1 site to regulate AR expression.

We also confirmed the anti-tumor effects of Z-K8

in vivo by measuring changes in the tumor volume

and in AR expression in tumor tissues. There were

no significant differences between the control and

Z-K8–treated groups regarding the body weight of

the animals, indicating that Z-K8 did not induce

drug-related toxicity (Fig. 6B). Even with a high Z-K8

dose of 30 mg/kg for 5 days, histological analyses of

various organs revealed very low or no drug-related

toxicities (data not shown). Hence, the inhibition of

LNCaP xenograft tumor growth by Z-K8 in vivo

reflected the results obtained in vitro.

In conclusion, Z-K8 had significant tumor cytotox-

icity effect on LNCaP cells as compared with E-K8.

In addition, the anti-tumor effect might be related

to the regulation of AR in vitro and in vivo. We sug-

gest that Z-K8 is a potent candidate for treatment of

PCa.
REFERENCES
1. Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics, 2011:

The impact of eliminating socioeconomic and racial disparities

on premature cancer deaths. CA Cancer J Clin 2011;61:212–236.

2. Liao Z, Wang S, Boileau TW, Erdman JW Jr, Clinton SK. In-

creased phospho-AKT is associated with loss of the androgen

receptor during the progression of N-methyl-N-nitrosourea-in-

duced prostate carcinogenesis in rats. Prostate 2005;64:186–199.

3. Yang M, Jiang P, Yamamoto N, Li L, Geller J, Moossa AR,

Hoffman RM. Real-time whole-body imaging of an orthotopic

metastatic prostate cancer model expressing red fluorescent

protein. Prostate 2005;62:374–379.

4. Litvinov IV, Antony L, Dalrymple SL, Becker R, Cheng L,

Isaacs JT. PC3, but not DU145, human prostate cancer cells re-

tain the coregulators required for tumor suppressor ability of

androgen receptor. Prostate 2006;66:1329–1338.

5. Chen YL, Lin SZ, Chang WL, Cheng YL, Harn HJ. Requirement

for ERK activation in acetone extract identified from Bupleu-

rum scorzonerifolium induced A549 tumor cell apoptosis and

keratin 8 phosphorylation. Life Sci 2005;76:2409–2420.

6. Cheng YL, Lee SC, Lin SZ, Chang WL, Chen YL, Tsai NM, Liu

YC, Tzao C, Yu DS, Harn HJ. Anti-proliferative activity of

Bupleurum scrozonerifolium in A549 human lung cancer cells

in vitro and in vivo. Cancer Lett 2005;222:183–193.

7. Chen YL, Lin SZ, Chang JY, Cheng YL, Tsai NM, Chen SP,

Chang WL, Harn HJ. In vitro and in vivo studies of a novel

Regulation of AR Expression by Z-Isochaihulactone  11
potential anticancer agent of isochaihulactone on human lung

cancer A549 cells. Biochem Pharmacol 2006;72:308–319.

8. Denis L, Morton MS, Griffiths K. Diet and its preventive role in

prostatic disease. Eur Urol 1999;35:377–387.

9. Han HY, Wang XH, Wang NL, Ling MT, Wong YC, Yao XS.

Lignans isolated from Campylotropis hirtella (Franch.)

Schindl. Decreased prostate specific antigen and androgen re-

ceptor expression in LNCaP cells. J Agric Food Chem 2008;56:

6928–6935.

10. Shin HJ, Lee BH, Yeo MG, Oh SH, Park JD, Park KK, Chung

JH, Moon CK, Lee MO. Induction of orphan nuclear receptor

Nur77 gene expression and its role in cadmium-induced apo-

ptosis in lung. Carcinogenesis 2004;25:1467–1475.

11. Faber PW, van Rooij HC, Schipper HJ, Brinkmann AO, Trap-

man J. Two different, overlapping pathways of transcription

initiation are active on the TATA-less human androgen recep-

tor promoter. The role of Sp1. J Biol Chem 1993;268:9296–9301.

12. Chiu SC, Wang MJ, Yang HH, Chen SP, Huang SY, Chen YL,

Lin SZ, Harn HJ, Pang CY. Activation of NAG-1 via JNK sig-

naling revealed an isochaihulactone-triggered cell death in hu-

man LNCaP prostate cancer cells. BMC Cancer 2011;11:146.

13. Ghavami S, Hashemi M, Ande SR, Yeganeh B, Xiao W, Eshra-

ghi M, Bus CJ, Kadkhoda K, Wiechec E, Halayko AJ, Los M.

Apoptosis and cancer: mutations within caspase genes. J Med

Genet 2009;46:497–510.

14. Eder IE, Culig Z, Ramoner R, Thurnher M, Putz T, Nessler-

Menardi C, Tiefenthaler M, Bartsch G, Klocker H. Inhibition of

LncaP prostate cancer cells by means of androgen receptor an-

tisense oligonucleotides. Cancer Gene Ther 2000;7:997–1007.

15. Ko YJ, Devi GR, London CA, Kayas A, Reddy MT, Iversen PL,

Bubley GJ, Balk SP. Androgen receptor down-regulation in

prostate cancer with phosphorodiamidate morpholino anti-

sense oligomers. J Urol 2004;172:1140–1144.

16. Liao X, Tang S, Thrasher JB, Griebling TL, Li B. Small-interfer-

ing RNA-induced androgen receptor silencing leads to apopto-

tic cell death in prostate cancer. Mol Cancer Ther 2005;4:505–

515.

17. Chiu FL, Lin JK. Downregulation of androgen receptor expres-



sion by luteolin causes inhibition of cell proliferation and

induction of apoptosis in human prostate cancer cells and

xenografts. Prostate 2008;68:61–71.

18. Kelly WK, Scher HI, Mazumdar M, Vlamis V, Schwartz M, Fos-

sa SD. Prostate-specific antigen as a measure of disease out-

come in metastatic hormone-refractory prostate cancer. J Clin

Oncol 1993;11:607–615.

19. Yuan H, Young CY, Tian Y, Liu Z, Zhang M, Lou H. Suppres-

sion of the androgen receptor function by quercetin through

protein–protein interactions of Sp1, c-Jun, and the androgen

receptor in human prostate cancer cells. Mol Cell Biochem

2010;339:253–262.

20. Ren F, Zhang S, Mitchell SH, Butler R, Young CY. Tea polyphe-

nols down-regulate the expression of the androgen receptor in

LNCaP prostate cancer cells. Oncogene 2000;19:1924–1932.

21. Yuan H, Gong A, Young CY. Involvement of transcription fac-

tor Sp1 in quercetin-mediated inhibitory effect on the androgen

receptor in human prostate cancer cells. Carcinogenesis 2005;



26:793–801.


The Prostate


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©anasahife.org 2016
rəhbərliyinə müraciət