Ana səhifə

Новикова ольга сергеевна использование экспериментального и биоинформатического подходов для исследования ретротранспозонов


Yüklə 274.08 Kb.
tarix08.05.2016
ölçüsü274.08 Kb.

На правах рукописи

НОВИКОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И БИОИНФОРМАТИЧЕСКОГО ПОДХОДОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ

В ГЕНОМАХ ЭУКАРИОТ
генетика – 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск, 2007

Работа выполнена в секторе молекулярной эволюции, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.
Научный руководитель: кандидат биологических наук Блинов Александр Геннадьевич,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бородин Павел Михайлович,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
доктор биологических наук,

член-корреспондент РАН

Сергей Викторович Нетесов,

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", Кольцово, Новосибирская область

Ведущее учреждение: Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

Защита диссертации состоится « _ » _______ 2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т/ф (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru


C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан « » ________ 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев



ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ретротранспозоны – мобильные элементы эукариот использующие в процессе перемещения процесс обратной транскрипции. Считается, что возникновение ретротранспозонов по времени совпадает с возникновением эукариот (Malik et al. 1999). Эти мобильные элементы найдены практически у всех эукариот, принадлежащих к различным таксономическим группам, таким, как микроорганизмы, грибы, животные и растения. Перемещение мобильных элементов, в частности ретротранспозонов, оказывает серьезное влияние на геном, например, вызывает многие известные фенотипические мутации у Drosophila melanogaster, а также некоторые генетические болезни человека. Из-за их перемещения может происходить дестабилизация генома, проявляющаяся в виде гибридного дисгенеза и геномных перестроек.

Несмотря на важность проблемы, в картине происхождения мобильных элементов остаются нерешенные вопросы. Особый интерес представляют исследования эволюции и распределения различных групп мобильных элементов среди эукариотических организмов, а также системы взаимодействия мобильный элемент – геном-“хозяин”. Частичное решение этого вопроса возможно при исследовании широкого круга эукариот экспериментальными и биоинфоматическими методами. Экспериментальные подходы дают исследо-вателю возможность выбирать практически любой объект, тогда как биоинфор-матический анализ геномных последовательностей позволяет осуществить поиск всех мобильных элементов, присутствующих в геноме.

Скорпионы (Arachnida: Scorpiones) относительно небольшой отряд хелицеровых, насчитывающий около 2000 видов и 180 родов (Soleglad et al. 2005). Отряд скорпионов представляет большой интерес для эволюционных биологов, так как является одним из древнейших отрядов сухопутных членистоногих (Brownell and Polis 2001). Исследования ретротранспозонов представителей такой малоизученной группы как отряд скорпионов могут дать ответы не только на вопросы эволюции и распределения ретротранспозонов внутри данной группы, но и помочь в решении вопросов происхождения и разнообразия ретротранспозонов у членистоногих.

Бабочки-голубянки рода Maculinea являются одним из интересных объектов изучения для экологов. Представители рода Maculinea – мирмекофилы, на последних стадиях гусеницы этих бабочек живут в муравейнике. Исследования ретротранспозонов Maculinea могут дать информацию не только об эволюции этой группы мобильных элементов у бабочек, но и могут быть полезны для популяционных биологов и экологов для решения вопросов сохранения биоразнообразия.

С установления полной нуклеотидной последовательности генома человека началась так называемая постгеномная эра развития биологии. Доступность полных геномных последовательностей многих эукариот дает возможность для исследования разнообразия ретротранспозонов при помощи компьютерных методов (анализ in silico). Геномы грибов относительно небольшие (Woestemeyer and Kreibich 2002), что делает их очень удобным объектом для геномных исследований. In silico анализ малых геномов требует меньше времени и ресурсов, а значит использование небольших геномов имеет преимущества при проверке правильности и эффективности выбранного подхода. Кроме того, грибы содержат небольшую, но очень разнообразную, фракцию повторенных последовательностей, в том числе и ретротранспозонов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение распространения и эволюции ретротранспозонов в геномах эукариотических организмов при помощи экспериментальных и биоинформатических подходов.

В конкретные задачи работы входило:



  1. Исследование разнообразия non-LTR ретротранспозонов среди представителей отряда Scorpiones (Arachnida: Scorpiones) и представителей рода Maculinea (Lepidoptera: Lycaenidae).

  2. Определение нуклеотидных последовательностей элементов, относя-щихся к различным группам non-LTR ретротранспозонов, из видов отряда Scorpiones и рода Maculinea.

  3. Обработка последовательностей, изучение внутри- и межвидовой вариа-бельности, оценка разнообразия групп non-LTR ретротранспозонов в геномах видов отряда Scorpiones и рода Maculinea. Построение филогенетических деревьев non-LTR ретротранспозонов.

  4. Исследование разнообразия LTR ретротранспозонов с помощью биоинформатических подходов в геномах семи эукариотических организмов, включая два вида грибов (Fungi) и пять видов животных (Animalia).

  5. Исследование разнообразия и получение полных последовательностей LTR ретротранспозонов из геномов Aspergillus fumigatus и A. nidulans (Fungi: Ascomycota). Анализ нуклеотидных последовательностей, построение филогенетических деревьев LTR ретротранспозонов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые было проведено исследование распространения, разнообразия и эволюции non-LTR ретротранспозонов в геномах представителей отряда Scorpiones и бабочек рода Maculinea. Полученные данные позволили выявить существование большого разнообразия линий non-LTR ретротранспозонов различных филогенетических групп у членистоногих, на примере представителей отряда Scorpiones и рода Maculinea. Обнаружен уникальный случай горизонтального переноса non-LTR ретротранспозона между бабочками семейств Bombycidae и Lycaenidae. На сегодняшний день описанный в данном исследовании случай горизонтального переноса является вторым доказанным случаем межвидового переноса non-LTR ретротранспозонов.

Совместно с программистами компании UniPro (Новосибирск) был разработан биоинформатический подход для поиска мобильных элементов в геномных последовательностях. Использование этого подхода позволило выявить разнообразие LTR ретротранспозонов в геномах грибов – Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans. Впервые было проведено исследование мобильных элементов на предмет наличия признаков гомолог-зависимой инактивации повторенных последовательностей в масштабах целого генома.



Обнаруженные ретротранспозоны могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров для дальнейших популяционных исследований. В частности, LTR ретротранспозоны могут быть использованы как маркеры для микробиологического мониторинга A. fumigatus, основного возбудителя аспергиллеза, в условиях современных лечебно-профилактических учреждений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 4-ой и 5-ой конференциях “Биоинформатика регуляции и структуры генома” (BGRS’2004, Новосибирск, 2004; BGRS2006, Новосибирск, 2006), на EMBO конференции “Молекулярные механизмы транспозиции, их регуляция и эволюция” (Роскоф, Франция, 2004), на конференции “Исследования экологии и охраны бабочек в Европе” (Лайпциг-Халле, Германия, 2005), на Международной молодежной научно-методической конференции “Проблемы молекулярной и клеточной биологии” (Томск, Россия, 2007).

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 8 работ и 2 приняты в печать.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 148 страницах печатного текста, содержит 18 таблиц и иллюстрирована 57 рисунками. В списке литературы приведено 279 источников.



МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение ДНК. Образцы Scorpiones были предоставлены доктором В. Фетом (Marshall University, USA). Личинки Maculinea были собраны E. Śliwińska (Jagiellonian University, Poland), имаго других Lepidoptera были любезно предоставлены к.б.н. О. Костериным (Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия) и д.б.н. В. Дубатоловым (Институт систематики и экологии животных СО РАН, Россия). Выделение тотальной ДНК осуществлялось согласно описанному протоколу (Sunnucks and Hales 1996).

ПЦР-амплификация, клонирование, секвенирование. При амплификации использовался стандартный протокол и описанные праймеры (Glushkov et al. 2005; Novikova et al. 2007). Клонирование осуществлялось согласно инструкции в векторе pGEM-T (Promega), определение нуклеотидной последовательности проводилось при помощи автоматического секвенирования с использованием реагента BigDye Terminator Ready Reaction Mix v.3.0 (Applied Biosystems).

Компьютерный анализ последовательностей. Множественное и попарные выравнивания полученных последовательностей осуществлялось при помощи программ ClustalW (Thompson et al. 2004). Филогенетические деревья были построены методом соединения ближайших соседей (NJ – Neighbor Joining) при помощи программы MEGA3.0 (Kumar et al. 2001). Для оценки достоверности топологии использовался бутстрэп-тест (Felsenstein 1985).

Анализ последовательностей геномов. Для анализа последовательностей геномов использовалась программа UniPro GenomeBrowser. Для поиска аминокислотных последовательностей совместно с программистами компании UniPro (Новосибирск) были разработаны приложения HMM (hidden Markov model) и Find ME, , алгоритм которых основан на использовании скрытых цепей Маркова (Eddy 1998). Программа UniPro GenomeBrowser и приложения доступны на веб-сайте: http://genome.unipro.ru/.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Non-LTR ретротранспозоны в геномах представителей отряда Scorpiones.

Проведенный анализ 22 видов скорпионов, относящихся к двум обширным подотрядам Buthida и Iurida, показал необычно высокое разнообразие non-LTR ретротранспозонов, присутствующих в геномах этих беспозвоночных. При помощи ПЦР скрининга было выявлено наличие четырех филогенетических групп (R1, CR1, Jockey и I), присутствие трех из них было подтверждено при помощи клонирования, секвенирования и сравнительного анализа полученных фрагментов. Помимо всего прочего, был проведен филогенетический анализ полученных фрагментов (рис. 1).




Рис. 1. Филогенетический анализ полученных фрагментов обратной транскриптазы для филогенетической группы CR1 из Scorpiones. Выделены три линии CR1-подобных элементов.


Подавляющее большин-ство полученных фраг-ментов обратной транс-криптазы для всех исследованных филогене-тических групп оказались фрагментами нарушенных мобильных элементов. Можно предположить, что обнаруженные элементы либо очень редко перемещаются в геномах скорпионов, либо вообще не перемещались последнее время.

Неожиданное разнообразие различных линий non-LTR ретротранспозонов было обнаружено внутри филогенетических групп CR1 и Jockey. Внутри группы Jockey согласно результатам филогенетического анализа по меньшей мере четыре линии ретротранспозонов, эволюционные отношения между которыми на данном этапе остались неразрешенными. Одна из линий внутри СR1 группы оказалась ближе к мобильным элементам позвоночных, чем беспозвоночных (рис. 1, кластер I). Долгое время считалось, что членистоногие представлены внутри филогенетической группы CR1 только элементами T1Q семейства. Однако, данное исследование показывает, что разнообразие семейств CR1-подобных элементов членистоногих гораздо больше.


Non-LTR ретротранспозоны в геномах представителей рода Maculinea.

Для поиска non-LTR ретротранспозонов в геномах бабочек рода Maculinea были выбраны четыре вида, наиболее распространенных на территории Европы: Maculinea teleius, M. nausithous, M. alcon и M. arion. При помощи ПЦР скрининга было выявлено наличие трех филогенетических групп (CR1, Jockey и R4), присутствие четырех филогенетических групп (R1, CR1, Jockey и R4) было показано при помощи клонирования, секвенирования и анализа полученных фрагментов.

Рис. 2. Филогенетический анализ полученных фрагментов обратной транскрпитазы для филогенетической группы CR1 из Maculinea.
Филогенетический анализ CR1 элементов Maculinea поз-волил выявить наличие трех семейств: MacCR1A, MacCR1B и MacCR1C (или T1Q) (рис. 3). Сравнение нуклеотидных после-довательностей показало в среднем 73.5% сходства между MacCR1A и MacCR1B. Однако, при сравнении аминокислотных последовательностей сходство было гораздо выше и составляло в среднем около 88%. Это означает, что элементы, отно-сящиеся к разным семействам, должны иметь отличный друг от друга кодонный состав.

Cосуществование двух се-мейств, достоверно различимых, но филогенетически очень близ-ких друг к другу, является интересным фактом с точки зрения возникновения новых семейств non-LTR ретротранспозонов в геномах (Eickbush et al. 1997), и может быть объяснено при помощи горизонтального переноса. В частности, различие в частотах используемых кодонов между мобильными элементами, а также между мобильными элементами и геномом организма-“хозяина”, являлось одним из первых аргументов в пользу существования горизонтального переноса мобильных элементов (Shields and Sharp 1989).


Горизонтальный перенос CR1B элементов.

Используя BLAST (алгоритм blastn) был проведен поиск non-LTR ретро-транспозонов подобных MacCR1A и MacCR1B в последовательностях других организмов. Положительный сигнал был получен только при сравнении элементов MacCR1B с геномными последовательностями тутового шелкопряда Bombyx mori. Сходство MacCR1B элементов с некоторыми фрагментами генома B. mori составляло более 96% на нуклеотидном уровне. Элемент BmCR1B (Bombyx mori CR1B) был реконструирован на основе сравнения геномных фрагментов.

Сходство BmCR1B с MacCR1B элементами составляло в среднем 96.1% на нуклеотидном уровне и 95% на аминокислотном. В тоже время, сходство с MacCR1A составляло 73.5% последовательности ДНК и 89% белковой последовательности. Столь высокое сходство BmCR1B и MacCR1B трудно объяснить вертикальной эволюцией элементов. Однако, высокого сходства последовательностей недостаточно для привлечения горизонтального переноса в качестве объяснения наблюдаемого явления (Malik et al. 1999). Дополнительными критериями могут быть данные о распространении элементов у близкородственных видов и скорость эволюции других кодирующих последовательностей (не мобильных элементов).
Рис. 3. Филогенетическое древо 9-ти надсемейств отряда Lepidoptera. Результаты ПЦР-анализа, показывающие присут-ствие CR1A и CR1B семейств.

Для исследования рас-пространения CR1A и CR1B семейств ретроэлементов были выбраны специфические прай-меры, ПЦР амплификация с которыми позволяла бы детектировать определенное се-мейство. Было выбрано 17 пред-ставителей отряда Lepidoptera, подотряда Ditrysia. В первую очередь, в анализ были включены несколько близкородственных к Maculinea видов из того же се-мейства Lycaenidae: Scolitantides orion, Shijimaeoides divina и Plebejus argus; а также один представитель Oberthueria caeca семейства Bombycidae, к которому отно-сится Bombyx mori. Согласно современным представ-лениям, семейство Lycaenidae входит в состав надсемейства Papilionoidea, в котором среди прочих выделяют также семейства Pieridae, Nymphalidae и Satyridae. Представители этих семейств также были включены в анализ. Кроме того, дополнительно было исследовано семь других надсемейств (рис. 3).

Специфические праймеры для CR1A семейства дали положительный сигнал при амплификации только с ДНК видов принадлежащих семейству Lycaenidae: S. orion, Sh. divina и P. argus. Представители двух родов Scolitantides и Shijimaeoides считаются эволюционно наиболее близкими к роду Maculinea среди представленных в данном исследовании (Als et al. 2004).

Результаты ПЦР анализа распределения CR1B семейства показали, что CR1B элементы помимо B. mori и видов рода Maculinea присутствуют также в геноме Oberthueria caeca. Ни одно из других семейств, кроме Bombycidae (и собственно Maculinea из Lycaenidae) не показало наличие элементов CR1B семейства. Неравномерное распределение CR1B семейства, его присутствие в геномах двух представителей Bombycidae и наличие у рода Maculinea в составе семейства Lycaenidae, дополнительное свидетельство в пользу горизонтального переноса CR1B элемента. Кроме того, так как CR1B элемент присутствует в геномах двух представителей семейства Bombycidae, которые по некоторым данным разошлись более 10 млн. лет назад (Дубатолов В., личное сообщение), можно предположить, что перенос произошел от Bombycidae к общему предку Maculinea, который существовал около 5 млн. лет назад (Als et al. 2004). Время расхождения двух семейств Bombycidae и Lycaenidae составляет 140 млн. лет (Gaunt and Miles 2002).

Дополнительным критерием для определения горизонтального переноса может служить сравнение расхождения аминокислотных последовательностей генов и мобильных элементов. Горизонтальные перенос может быть обнаружен, если скорость накопления замен в последовательностях мобильных элементов окажется ниже, чем для функциональных генов (Zupunski et al. 2001).

Ген фактора элонгации (EF-1α) единственный ген ядерной ДНК Maculinea доступный в базах данных. Необходимо заметить, что EF-1α один из самых консервативных генов эукариот, используемый для исследований эволюционных отношения на высоких таксономических уровнях (Brower and DeSalle 1994). Сравнение аминокислотных последовательности EF-1α из Maculinea и Bombyx показало, что количество замен на единицу длины для EF-1α Bombyx / EF-1α Maculinea и BmCR1B / MacCR1B примерно одинаково (2.7%).

Механизм горизонтального переноса неизвестен. Предполагается, что в этом процессе могут участвовать некие промежуточные “хозяева”-вектора, такие как бактерии, внутриклеточные паразиты, симбионты, вирусы и другие потенциальные переносчики. Направление горизонтального переноса также остается под вопросом. Маловероятно, что перенос произошел независимо и одновременно в представителей двух далеких таксонов из некого третьего организма. С другой стороны, CR1B семейство присутствует у представителей двух родов семейства Bombycidae, Bombyx mori и Oberthueria caeca, и только у одного рода семейства Lycaenidae и, судя по всему, отсутствует у близкородственных родов Scolitantides и Shijimaeoides. Можно предположить, что перенос произошел от представителя семейства Bombycidae в общего предка видов рода Maculinea, то есть примерно 5-10 млн. лет назад (Als et al. 2004).
Поиск LTR ретротранспозонов в полных геномных последовательностях эукариот.

Совместно с программистами компании UniPro (Новосибирск) был разработан биоинформатический подход для поиска мобильных элементов в геномных последовательностях. Этот подход был применен для скрининга геномов организмов из различных таксономических групп царства грибов (Fungi) и царства животных (Animalia): аскомицетов из грибов; нематод, членистоногих и хордовых из царства животных (Таблица 1). В общей сложности, проведенный in silico анализ позволил выявить 19 новых LTR ретротранспозонов в геномах 7 эукариотических организмов, в том числе и в тех, которые были исследованы ранее. Более детальный, чем для других организмов, анализ был проведен для представителей царства грибов. Геномы грибов относительно небольшие, от 2 до 45 млн.п.н. (Woestemeyer and Kreibich 2002), что делает их очень удобным объектом для геномных исследований.


Таблица 1. Список исследованных видов эукариот, их таксономия и группы LTR ретротранспозонов.

Царство / Тип

Вид


PV

Bel

Dirs

MV

Новых LTR

Fungi / Ascomycota

Aspergillus fumigatus


.

.

.

+(2)

2



Aspergillus nidulans


.

.

.

+(2)

2

Animalia / Nematoda

Caenorhabditis briggsae


.

+(1)

+(1)

+(2)

4



Brugia malayi


.

+(1)

.

.

1

Animalia / Arthropoda

Aedes aegypti


+

+(1)

.

+(5)

6

Animalia / Chordata

Ciona intestinalis


.

+(1)

.

+(2)

3



Danio rerio


+

+

+

+(1)

1

“+” - были обнаружены LTR ретротранспозоны данной группы; числа в скобках соответствуют количеству обнаруженных новых элементов; PV и MV – Pseudoviridae и Metaviridae, соответственно.
LTR ретротранспозоны в геномах Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans.

Поиск LTR ретротранспозонов in silico в двух геномах представителей рода Aspergillus: A. fumigatus и A. nidulans, выявил существенные различия в составе семейств ретротранспозонов между исследованными видами. Единственное семейство, представленное элементами Dane3 и Afut4, присутствует у обоих видов, все остальные семейства являются видоспецифичными. В то же время, Dane1 и Dane2 (Nielsen et al. 2001), не обнаруженные у исследованной линии A. nidulans FGSC A4, формируют на филогенетическом древе единое семейство с Afut2 элементом из A. fumigatus (рис. 4).

Четыре семейства LTR ретротранспозонов присутствуют в геноме A. fumigatus, два из которых были обнаружены ранее (Neuveglise et al. 1996; Paris and Latge 2001), а два – Afut3 и Afut4 – описаны впервые. Семейства отличаются по копийности элементов. Так, Afut3 и Afut4 являются низкокопийными, в то время как Afut1 и Afut2 представлены десятками копий на геном. Подавляющее большинство элементов представляют собой нарушенные копии.

Два семейства элементов были найдены у A. nidulans дополнительно к уже описанным элементам Dane1 и Dane2 (Nielsen et al. 2001). В отличие от A. fumigatus, в геноме которого отсутствуют копии ретротранспозонов с ненарушенными кодирующими частями, для элемента Dane4 из A. nidulans было выявлено наличие целостных копий. Большое число нарушенных копий, как результат множественных транзиций C:G на T:A, может свидетельствовать о направленной инактивации ретроэлементов у исследованных видов Aspergillus.



Рис. 4. Филогенетическое древо (NJ) LTR ретротранспозонов группы Metaviridae. Для каждого элемента, за названием вида-хозяина следует номер последовательности в GenBank базе данных или имя локуса (locus name) согласно Repbase.




Гомолог-зависимая инактивация LTR ретротранспозонов Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans.

Метилирование ДНК – один из эпигенетических механизмов регуляции активности генов эукариот. В результате гиперметилирования происходит инактивация повторяющихся последовательностей, в том числе и мобильных элементов (Kricker et al. 1992). Инактивация повторяющихся последо-вательностей или гомолог-зависимая инактивация генов на сегодняшний день известна для множества эукариотических организмов – грибов, растений и животных (Colot and Rossingol 1999; Selker 1999; Faugeron 2000; Galagan and Selker 2004).

Один из механизмов гомолог-зависимой инактивации, отличающийся от простого гиперметилирования и приводящий к необратимым изменениям геномной последовательности, обнаружен у N. crassa. Мутагенез, индуци-рованный повторяющимися последовательностями (RIP – repeat induced point mutations) характеризуется транзициями C:G на T:A в повторенных последовательностях (Selker 1999; Galagan and Selker 2004). Как показывают исследования N. crassa, более чем 30% C:G пар в динуклеотидах CpA в обеих дуплицированных последовательностях могут быть подвержены мутагенезу за один пассаж (Galagan and Selker 2004).

Предполагая, что мобильные элементы A. fumigatus и A. nidulans находятся или находились под действием механизмов, схожих с RIP инактивацией N. crassa (Galagan and Selker 2004), был проведен RIP-анализ, который включал в себя: (1) сравнительный анализ нескольких копий элементов для каждого из семейств; (2) подсчет частот встречаемости динуклеотидов CpG, CpA, TpG и TpA для каждой из копий; (3) сравнение частот встречаемости динуклеотидов в последовательностях мобильных элементов и структурных генов. Предполагается, что структурные гены не являются мишенями RIP инактивации, а значит, существенные отличия между структурными генами и мобильными элементами будут свидетельствовать об изменениях нуклеотидного состава последних.

Анализ последовательностей копий мобильных элементов и структурных генов A. fumigatus и A. nidulans показал существенные различия в частотах встречаемости CpG динуклеотидов между ретротранспозонами и структурными генами.

Ранее предполагалось, что мишенями для мутагенеза повторенных после-довательностей у A. fumigatus являлись CpG динуклеотиды (Neuveglise et al. 1996; Paris and Latge 2001). Однако, проведенный в данном исследовании анализ показывает, что Afut1 и Afut2 последовательности имеют существенный дефицит не только по CpG, но и по CpA+TpG динуклеотидам в сравнении с функциоанльными генами (рис. 5).



Рис. 5. Бокс-плот частот встречаемости CpG, TpA, CpG и TpG сайтов для Afut1 и Afut2 в сравнении с функциональными генами.

Две гипотезы могут быть предложены: (1) направленный мутагенез иссле-дованных копий Afut1 и Afut2 прошел как по CpG, так и по CpA+TpG сайтам и привел к значительному избытку TpA динуклеотидов; (2) направленный мутагенез у A. fumigatus осуществлялся только по CpA+TpG сайтам, а дефицит CpG динуклеотидов возник в результате пассивного дезаминирования 5-метилцитозинов после метилирования. Данные о метилировании цитозинов и присутствии 5-метилцитозинов в последовательностях ДНК представителей рода Aspergillus противоречивы. Долгое время считалось, что 5-метилцитозин достаточно редко встречается в геномах Aspergillus (Tamame et al. 1983). Однако, последние данные свиде-тельствуют о том, что ДНК A. flavus содержит модифицированные цитозины (Gowher et al. 2001), а A. nidulans имеет ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу гомологичную Masc1 из Ascobulus immersus, которая отвечает за метилирование повторенных последовательностей (Faugeron 2000; Gowher et al. 2001). Таким образом, гипотеза о мутагенезе по двум сайтам одновременно представляется более вероятной.

В отличие от Afut элементов, при анализе Dane LTR ретротранспозонов A. nidulans оказалось, что частоты встречаемости CpA+TpG в среднем такие же, как и для структурных генов, а частоты встречаемости CpG и TpA Dane4 отличаются от таковых для генов примерно на одну величину. Можно предположить, что если направленный мутагенез действовал на повторенные последовательности A. nidulans, то сайтами метилирования-дезаминирования являлись CpG динуклеотиды. Кроме того, судя по частотам встречаемости сайтов, метилированные сайты CpG были дезаминированы по обоим цитозинам. Это могло произойти как пассивно, так и при помощи специальных ферментов (активное дезаминирование).


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование экспериментальных и биоинформатических подходов дает широкие возможности в исследованиях эволюции и распространения различных групп мобильных элементов среди эукариот, а также системы взаимодействия мобильный элемент – геном-“хозяин”. Экспериментальные подходы позволяют исследователю выбирать практически любой объект для изучения, тогда как с помощью биоинформатического анализа геномных последовательностей можно осуществить поиск всех мобильных элементов в масштабах целого генома.

Исследование 22-х видов отряда Scorpiones при помощи экспериментального подхода показало наличие множественных линий non-LTR ретротранспозонов в геномах этих животных. Однако подавляющее большинство обнаруженных элементов оказались нарушенными копиями, что свидетельствует об относи-тельно давних перемещениях этих элементов. Противоположная ситуация была выявлена при исследовании non-LTR ретротранспозонов четырех видов бабочек-голубянок рода Maculinea. Большинство обнаруженных мобильных элементов представляли собой интактные копии и, скорее всего, были активны относительно недавно и, возможно, активны в настоящее время. Так как мобильные элементы, в частности ретротранспозоны, участвуют в организации и функционировании геномов, составляя значительную фракцию, то можно предположить, что non-LTR ретротранспозоны Maculinea сыграли существенную роль в эволюции геномов представителей этого рода. Более того, был обнаружен горизонтальный перенос – одно из интересных и чрезвычайно редких явлений эволюции ретротранспозонов, особенно non-LTR ретроэлементов (Malik et al. 1999).

Горизонтальный перенос CR1B элементов произошел 5-10 млн. лет назад из представителя семейства Bombycidae в общего предка бабочек рода Maculinea. Несмотря на то, что увеличение копийности мобильных элементов сыграло одну из ключевых ролей в становлении геномов многих эукариот, неограниченное и нерегулируемое перемещение мобильных элементов, особенно ретротранс-позонов, способных увеличивать количество копий на геном, может иметь плачевные последствия для организма-“хозяина”. Предполагается, что в процессе совместной эволюции мобильных элементов и клетки “хозяина” возникают различные механизмы регуляции активности перемещения мобильных элементов (Kumar and Bennetzen 1999). Возникновение новых элементов в результате горизонтального переноса в геноме общего предка Maculinea не могло пройти бесследно. Отсутствие механизмов регуляции перемещения должно было привести к активной экспансии CR1B элементов. Таким образом, произошедший перенос CR1B ретротранспозонов должен был сыграть не последнюю роль в становлении и эволюции геномов рода Maculinea.

Исследование LTR ретротранспозонов при помощи биоинформатических подходов в масштабах геномов двух грибов-аскомицетов, Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans, позволило оценить копийность и разнообразие LTR ретротранспозонов, а также выявить их структурную организацию. Однако возможности анализа in silico не ограничиваются лишь исследованием разнообразия и структурной организации мобильных элементов. Сравнительное исследование нуклеотидных последовательностей LTR ретротранспозонов A. fumigatus и A. nidulans показало наличие множественных транзиций C:G на T:A, что свидетельствует о произошедшей инактивации по типу RIP (repeat induced point mutation – мутагенез, индуцированный повторяющимися последователь-ностями) (Galagan and Selker 2004).

Более детальный анализ последовательностей подтвердил, что LTR ретротранспозоны подверглись RIP-подобной инактивации. Гомолог-зависимая инактивация по типу RIP очень интересное явление не только с точки зрения эволюции мобильных элементов, как повторенных последовательностей, но и с точки зрения эволюции всего организма. Так как в процессе RIP инактивации происходит метилирование-дезаминирование цитозинов в любой повторенной последовательности, то один из основных процессов возникновения новых генов за счет дупликации становится невозможным. Любопытно, что сайты, по которым произошло предполагаемое метилирование-дезаминирование отли-чаются у A. fumigatus и A. nidulans. Если у A. fumigatus сайтами RIP-подобной инактивации являлись CpG и CpA динуклеотиды, то у A. nidulans, судя по всему, только CpG динуклеотиды. Анализ мобильных элементов на предмет наличия признаков RIP инактивации впервые проведен в масштабах целых геномов.



Таким образом, использование экспериментального и биоинформатического подходов в исследовании дает возможности для разрешения множества вопросов и изучения различных аспектов распространения и эволюции мобильных элементов.
ВЫВОДЫ

  1. Исследовано разнообразие non-LTR ретротранспозонов в геномах 22-х видов отряда Scorpiones. Показано присутствие трех филогенетических групп non-LTR ретротранспозонов (CR1, Jockey и I) и множественных линий внутри обнаруженных групп. Разнообразие CR1-подобных non-LTR ретротранс-позонов скорпионов оказалось выше, чем известное до сих пор для других членистоногих. Большинство non-LTR ретротранспозонов оказались нару-шенными копиями, что свидетельствует об их относительно давних перемещениях.

  2. Исследовано разнообразие non-LTR ретротранспозонов в геномах четырех видов бабочек рода Maculinea. Показано присутствие четырех филогенетических групп non-LTR ретротранспозонов (CR1, R1, Jockey и R4) и наличие множественных линий внутри них, в частности – сосуществование двух близкородственных семейств MacCR1A и MacCR1B CR1-подобных ретроэлементов. Высокое сходство последовательностей элементов внутри обоих семейств свидетельствует об их недавней транспозиционной активности.

  3. На основе сравнения нуклеотидных последовательностей MacCR1B и доступных в базах данных, был обнаружен BmCR1B элемент в геноме Bombyx mori, имеющий высокое сходство с MacCR1B элементом Maculinea. Используя фрагменты генома B. mori полная последовательность BmCR1B элемент была реконструирована.

  4. Исследование распределения CR1B и CR1A семейств non-LTR ретротранспозонов среди представителей подотряда Ditrysia отряда Lepidoptera показало, что CR1B элементы присутствуют только у Maculinea (семейство Lycaenidae) и двух представителей семейства Bombycidae. Неравномерное распределение, очень высокая консервативность последовательностей в сравнении с ядерным геном EF-1α и медленная скорость эволюции являются доказательствами произошедшего горизонтального переноса CR1B non-LTR ретротранспозонов между представителем семейства Bombycidae и общим предком рода Maculinea более 5 млн. лет назад. На сегодняшний день описанное в данном исследовании явление горизонтального переноса является вторым доказанным случаем межвидового переноса non-LTR ретротранс-позонов.

  5. Исследовано разнообразие LTR ретротранспозонов в геномах восьми эукариотических организмов, включая три представителя царства грибов (Fungi) и пять представителей царства животных (Animalia). Для этого совместно с программистами компании UniPro (Новосибирск) был разработан и протестирован биоинформатический подход, позволяющий осуществлять анализ полных геномных последовательностей на предмет наличия мобильных элементов. Было обнаружено 19 новых, ранее не описанных, LTR ретротранспозонов в геномах 7 эукариотических организмов. Показано, что метод поиска является эффективным для детекции LTR ретротранспозонов.

  6. С помощью разработанного метода проведен анализ полных геномных последовательностей геномов двух аскомицетов, Aspergillus fumigatus и A. nidulans. Помимо известных семейств LTR ретротранспозонов Afut1, Afut2 A. fumigatus и Dane1,2 A. nidulans, для каждого вида было обнаружено по два семейства LTR ретротранспозонов, которые не были описаны ранее. Анализ полных нуклеотидных последовательностей элементов показал наличие множественных транзиций C:G на T:A, что свидетельствует о действии гомолог-зависимой инактивации по типу RIP.

  7. Впервые было проведено исследование мобильных элементов на предмет наличия признаков гомолог-зависимой инактивации повторенных последовательностей в масштабах целого генома. Проведен RIP анализ, который включал в себя подсчет частот встречаемости динуклеотидов CpG, CpA, TpG и TpA как для LTR ретротранспозонов, так и для функциональных генов. RIP анализ убедительно показал, что последовательности LTR ретротранспозонов A. fumigatus и A. nidulans несут отпечатки действия RIP-подобной инактивации.



Список публикаций по теме диссертации


  1. Novikova O., Fursov M., Beresikov E., Blinov A. New LTR retrotransposable elements from eukaryotic genomes // Proceedings of the fourth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure – BGRS. 2004. Novosibirsk, Russia. V. 2. P. 220-224.

  2. Beresikov E., Novikova O., Makarevich I., Lashina V., Plasterk R., Blinov A. Evolutionary relationships and distribution of non-LTR retrotransposons in eukaryotes // Proceedings of the fourth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure – BGRS. 2004. Novosibirsk, Russia. V. 2. P. 181-184.

  3. Glushkov S., Novikova O., Blinov A., Fet V. Divergent non-LTR retrotransposon lineages from the genomes of scorpions (Arachnida: Scorpiones) // Mol. Genet. Genomics. 2005. V. 275. P. 288-296.

  4. Novikova O., Śliwińska E., Blinov A., Woyciechowski M. Non-LTR retrotransposons from large blue butterfly Maculinea teleius: the diversity of CR1-like elements // In: Studies on the ecology and conservation of butterflies in Europe. Settele J., Kuehn E., Thomas J. (eds.). Pensoft. Sofia-Moscow. 2005. V. 2. P. 184-188.

  5. Novikova O., Fursov M., Berezikov E., Blinov A. 2006. New LTR retrotransposable elements from eukaryotic genomes // In: Bioinformatics of genome regulation and structure II. Kolchanov N., Hofestaedt R., Milanesi L. (eds). Springer. 2006. P. 131-140.

  6. Kabanova A., Novikova O., Gunbin K., Fet V., Blinov A. Evolutionary relationships and distribution of the different LTR retrotransposon families in plants // Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure - BGRS. 2006. Novosibirsk, Russia. V. 3. P. 163-166.

  7. Novikova O., Fursov M., Blinov A. New family of LTR retrotransposable elements from fungi // Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure - BGRS. 2006. Novosibirsk, Russia. V. 3. P. 195-198.

  8. Novikova O., Śliwińska E., Fet V., Settele J., Blinov A., Woyciechowski M. CR1 clade of non-LTR retrotransposons from Maculinea butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae): evidence for recent horizontal transmission // BMC Evol. Biol. 2007. V. 7. P. 93

  9. Новикова О., Фет В., Блинов А. LTR ретротранспозоны в геномах Aspergillus fumigatus и A. nidulans // Мол. Биол. 2007. (принята в печать).

  10. Новикова О., Фет В., Блинов А. Гомолог-зависимая инактивация LTR ретротранспозонов в геномах Aspergillus fumigatus и A. nidulans // Мол. Биол. 2007. (принята в печать).



Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©anasahife.org 2016
rəhbərliyinə müraciət