Ana səhifə

Citra resdia megasari


Yüklə 19.4 Kb.
tarix02.05.2016
ölçüsü19.4 Kb.
Piruvat Dekarboksilase

CITRA RESDIA MEGASARI



Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Institut Teknologi Bandung, Indonesia

Piruvat dekarboksilase adalah enzim dari golongan liase. Enzim ini mengkatalisis reaksi dekarboksilasi asam piruvat menjadi asetaldehid dan karbondioksida. Enzim ini banyak ditemukan dalam tanaman, jamur (fungi), dan bakteri, namun saat ini lebih banyak piruvat dekarboksilase diisolasi dari bakteri karena aktivitasnya yang lebih tinggi daripada piruvat dekarboksilase dari sumber-sumber lain meskipun jumlah enzim yang dapat diisolasi lebih sedikit. Penggunaan enzim piruvat dekarboksilase terutama dalam sintesis etanol. Selain itu juga dapat digunakan dalam industri farmasi sebagai senyawa prekursor.





1. PENDAHULUAN



Piruvat dekarboksilase adalah enzim homotetrametri (EC 4.1.1.1) yang mengkatalisis reaksi dekarboksilasi asam piruvat menjadi asetaldehid dan karbondioksida. Enzim ini juga biasa disebut asam 2-okso karboksilase dan asam keto karboksilase. Enzim ini diketahui bersifat sangat stabil dan sangat mudah dimurnikan.



Gambar 1. Enzim Piruvat dekarboksilase

Enzim ini memiliki struktur beta-alfa-beta, menghaslikan bentuk beta-sheet paralel. Piruvat dekarboksilase mengandung 563 residu di tiap-tiap dimernya; enzim ini memiliki interaksi intermonomer yang kuat, namun tidak demikian dengan antaraksi dimernya dalam membentuk tetramer.

Enzim piruvat dekarboksilase merupakan suatu dimmer, oleh karena itu mempunyai 2 sisi aktif. Sisi aktif ini berada dalam inti enzim dimana dapat terjadi ikatan hydrogen dan dimana piruvat bereaksi dengan TPP. Masing-masing sisi aktif memiliki 20 asam amino, termasuk asam Glu 477 (yang berperan dalam kestabilan cincin TPP) dan Glu 51 (berfungsi dalam pengikatan kofaktor). Lingkungan di sekitar Glu 477 sangat nonpolar, hal ini bertujuan untuk membuat pKa yang lebih tinggi dari normal (pKa Glu dan Asp normal sekitar 4.6). Residu lipofilik Ile 476, Ile 480, dan Pro 26 berperan dalam pembentukan daerah nonpolar di sekitar Glu 477. Enzim piruvat dekarboksilase membutuhkan juga kofaktor yaitu TPP dan Mg2+.



Gambar 2. Sisi Aktif Piruvat Dekarboksilase

Dalam kondisi aerob, enzim ini adalah enzim pertama (dari tiga enzim kompleks yang dikenal sebagai kompleks piruvat dehidrogenase) yang mengkonversi piruvat (hasil glikolisis) menjadi asetil CoA. Dalam kondisi anaerob, enzim ini merupakan bagian dalam proses fermentasi ragi, terutama dari ragi genus Saccharomyces, untuk menghasilkan etanol. Piruvat dekarboksilase memulai proses ini dengan mengkonversi piruvat menjadi asetaldehid dan karbondioksida. Untuk melakukan ini, dibutuhkan dua tiamin fosfat (TPP) dan dua ion magnesium sebagai kofaktor. Dalam tubuh manusia (kondisi aerob) enzim ini bekerja mengkonversi piruvat menjadi asetaldehid dan hidroksetil-TPP untuk masuk dalam siklus asam sitrat. Sementara pada ragi (kondisi anaerob), enzim mempunyai 2 fungsi, pertama untuk mengkonversi piruvat menjadi hidroksetil-TPP. Kedua untuk memindahkan gugus hidroksietil yang terikat pada TPP ke lipoamida dari E2 (yang merupakan komponen dari piruvat dekarboksilase). Perpindahan ini mengakibatkan piruvat dekarboksilase kembali ke bentuk asalnya dan siap untuk mengkatalisis reaksi selanjutnya. Reaksi ini terjadi di matriks mitokondria. Dalam ragi, piruvat dekarboksilase berperan selama proses fermentasi dan menghasilkan fragmen 2-karbon sebagai asetaldehid ditambah karbondioksida.

Piruvat dekarboksilase mengeliminasi CO yang tidak diperlukan oleh sel. Enzim ini juga menghasilkan etanol yang digunakan sebagai antibotik untuk menghilangkan organisme-organisme yang tidak dibutuhkan. Enzim ini sangat penting untuk membantu proses dekarboksilasi asam alfa-keto karena dapat membentuk muatan negatif pada atom karbon karbonil dalam keadaan transisi; oleh karena itu, enzim menyediakan kondisi yang sesuai untuk TPP dan asam alfa-keto (piruvat) untuk ‘bertemu’. Mekanisme reaksi yang dikatalisis oleh piruvat dekarboksilase :



Gambar 3. Mekanisme reaksi yang dikatalisis oleh piruvat dekarboksilase

2. ISOLASI DAN PEMURNIAN ENZIM

Enzim piruvat dekarboksilase dapat diisolasi dari jamur (fungi) dan tanaman, jarang ditemukan dalam bakteri. Hanya terdapat 3 bakteri yang dapat menghasilkan enzim Piruvat dekarboksilase, yaitu : Zymomonas mobilis, Sarcina ventriculi , dan Acetobacter pasteurianus. Namun diketahui bahwa aktivitas enzim ini dalam bakteri Zymomonas mobilis lebih tinggi daripada enzim yang berasal dari sumber-sumber lainnya, bahkan dalam sitoplasma ragi pun tidak terdapat aktivitas sebesar itu. Oleh karena itu, enzim Piruvat Dekarboksilase yang berasal dari Z. mobilis ini biasa digunakan dalam industri.

Enzim ini mengandung lebih dari 5% protein yang larut dalam Z. mobilis yang ditumbuhkan dalam kondisi normal dengan substrat glukosa pada 30-32C, pada pH 5-6. Tidak adanya aktivitas proteolitik dalam Z. mobilis menjadikannya sumber enzim yang ideal saat pemurnian. Piruvat dekarboksilase yang berasal dari ragi dikenal mudah rusak akibat adanya proses degradasi proteolitik selama isolasi. Walaupun aktifitas spesifiknya tinggi namun enzim yang dihasilkannya sedikit. Sehingga untuk masuk ke tahap selanjutnya (yaitu fermentative flux) dibutuhkan jumlah enzim 10 kali lebih besar dari jumlah enzim yang diperoleh dari proses ekstraksi. L. O. Ingram dan S. Bringer-Meyer mengajukan teknik pemurnian yang lain yang menghasilkan enzim murni lebih banyak, yaitu sampai 4 mg /gram sel. Karena tingginya tingkat enzim dalam Z. mobilis, maka promotor dan daerah pengikat ribosom pada gen pengkode piruvat dekarboksilase harus berdekatan (sistem ekspresi protein yang ideal).

Pada tahap isolasi, pertama-tama strain Z. mobilis ditumbuhkan dalam media dengan substrat 15-18% glukosa, kemudian dipanen dengan cara sentrifuga. Kemudian dipilih fragmen DNA Z. mobilis sebanyak 2- sampai 6- kilobasa untuk dimasukkan ke dalam plasmid pUC9 dengan bantuan enzim restriksi endonuklease (untuk memotong plasmid) dan enzim ligase (untuk menyambung plasmid dengan fragmen DNA). Plasmid kemudian dimasukkan ke dalam Escherichia coli yang kemudian dikulturkan.

Untuk mengisolasi protein, E.coli dilisis dengan Nondiet P-40 dan lisozim, dengan penambahan buffer pH 6.5. Aktivitas akan enzim hilang apabila pH ekstrak >7.0. Pada tahap lisis ini dilakukan pengocokan dengan vortex (dengan adanya serbuk kaca berukuran 50-150 µm).

Pemurnian enzim yang dihasilkan dilakukan dengan teknik kromatografi layaknya protein kebanyakan. Teknik kromatografi yang dilakukan dalam percobaan ini adalah kromatografi ligan pewarna (Dye-Ligand Chromatography) dan kromatografi penukar ion.

Pada kromatografi ligan pewarna, digunakan 2 jenis kolom yaitu kolom Green H-E4BD Sepharose CL-4B dan Yellow H-E4R Sepharose CL-4B. 400 mL ekstrak (mengandung 5000 mg protein) pertama-tama dialirkan dalam kolom Green H-E4BD Sepharose CL-4B pada pH 6.0. Adsorben dalam kolom ini merupakan adsorben negative sehingga materi yang tidak teradsorbsi adalah materi yang mengandung enzim Piruvat Dekarboksilase (enzim ini bermuatan negatif). Hasil dari kromatografi pada kolom pertama (materi yang tidak teradsorbsi) kemudian dialirkan dalam kolom Yellow H-E4R Sepharose CL-4B pada pH 5.5. Protein yang mengandung Piruvat Dekarboksilase diadsorbsi dalam kolom dan kemudian dielusi dengan buffer pH 6.0. Pada pH 5.5 enzim akan diadsorbsi oleh kolom H-E4R. Enzim dielusi dari kolom dengan menaikan pH, lebih baik dengan kenaikan kekuatan ion yang simultan, sehingga seluruh protein yang terikat dapat dipindahkan.

Protein yang dihasilkan kemudian diendapkan dengan ammonium sulfat dan disentrifugasi untuk memisahkan endapan dengan supernatan.

Setelah dimurnikan dengan kromatografi ligan pewarna, dilakukan pemurnian selanjutnya dengan kromatografi penukar ion. Kolom untuk kromatografi ini dibuat dari DEAE-Trisacryl atau DEAE-Sephacel. Kolom DEAE-Trisacryl atau DEAE-Sephacel diharapkan dapat memisahkan Piruvat Dekarboksilase dari kontaminan-kontaminan yang tersisa.

Endapan protein (hasil dari kromatografi ligan pewarna) dilarutkan dalam 40 mL buffer pH 7.0 dan dihilangkan garamnya. Larutan protein kemudian dialirkan dalam kolom. Enzim Piruvat Dekarboksilase akan terikat pada kolom. Enzim ini kemudian dielusi dengan buffer mengandung MgCl2. Hasil dari tahap ini kemudian dielektroforesis dengan SDS-PAGe.

Hasil dari isolasi dan pemurnian Piruvat Dekarboksilase ini dapat dilihat dari tabel berikut :

Dari tabel tersebut dapat kita lihat bahwa aktivitas spesifik enzim semakin meningkat di setiap tahap pemurnian. Data Elektroforesis juga menunjukkan bahwa enzim yang diperoleh di akhir percobaan merupakan enzim murni.

Dari percobaan diketahui pula bahwa Piruvat Dekarboksilase yang berasal dari Z. mobilis memiliki sifat-sifat yang mirip dengan Piruvat Dekarboksilase dari ragi. Aktifitas enzim akan hilang tanpa adanya TPP (Thiamine Pyrophosphate), juga bila enzim berada pada kondisi pH diatas 7. Enzim memiliki aktivitas yang tinggi terhadap substrat dan pH optimum mendekati pH fisiologis. Hal ini dapat kita lihat dari grafik berikut :



3. APLIKASI

Penggunaan terbesar enzim piruvat dekarboksilase adalah dalam produksi etanol dengan bantuan enzim alkohol dehidrogenase (ADH).



Seperti kita ketahui saat ini etanol sedang banyak digunakan terutama untuk kebutuhan bahan bakar alternative bioetanol. Selain untuk produksi etanol, piruvat dekarboksilase juga digunakan sebagai katalis sintesis senyawa asimetrik karbinol (contoh : prekursor-prekursor kiral) untuk kebutuhan fasmasi seperti ephedrine dan pseudoephedrine.



Daftar Pustaka

  1. http://aem.asm.org/cgi/content/full/65/2/523

  2. http://www.interscience.wiley.com/journal/110547829/abstract

  3. http://www.publish.csiro.au/paper/PP9800035.htm

  4. http://www.en.wikipedia.com/pyruvate decarboxylase.html

  5. http://www.en.wikipedia.com/pyruvate decarboxylation.html

  6. Neale, Alan. D., Scopes, Robert. K., Wettenhall, Richard E. H., Hoogenraad, Nicholas J. (1986). “Pyruvate Decarboxylase of Zymomonas mobilis: Isolation, Properties, and Genetic Expression in Escherichia coli”. Journal of Bacteriology 169:1024-1028







Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©anasahife.org 2016
rəhbərliyinə müraciət