Ana səhifə

Bab I pendahuluan


Yüklə 281.3 Kb.
tarix08.05.2016
ölçüsü281.3 Kb.
BAB I PENDAHULUAN
Aplikasi enzim di industri semakin menuntut enzim yang bersifat tahan lingkungan. Suhu merupakan faktor utama yang paling merusak enzim,maka usaha pertama yang akan dilakukan adalah mencari mikroba penghasil enzim- enzim termofilik dari berbagai sumber alam. Hal ini berkaitan dengan keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi dilakukan pada suhu tinggi, diantaranya adalah mengurangi kontaminasi, meningkatkan kecepatan transfer massa dan menurunkan viskositas larutan.

Kebutuhan dunia akan enzim¬enzim altematif yang mampu melakukan aktivitasnya pada kondisi ekstrim, salah satunya adalah enzim termostabil yang mampu bekerja pada temperatur tinggi. Biokatalis jenis ini mampu memberi sumbangan besar baik untuk pengembangan ilmu dasar maupun bidang industri. Rahayu S. (1999) menyatakan pendekatan dengan mencari sumber sumber enzim baru dari mikroorganisme termofilik yang diisolasi dari lingkungan unik merupakan langkah yang paling memungkinkan dilakukan, karena Indonesia memiliki banyak daerah dengan temperatur yang tinggi, seperti daerah sumber air panas ataupun daerah di sekitar kawah pasca erupsi yang potensial dan unik. Aplikasi enzim termostabil lebih disukai di bidang industri mengingat keuntungan yang diperoleh jika proses produksi dilakukan pada suhu tinggi. Enzim termostabil dihasilkan oleh bakteri termofilik karena lingkungan hidupnya yang ekstrem seperti daerah sumber air panas, daerah kawah gunung berapi, dan daerah ekstrem lain.

Salah satu sumber potensial enzim termostabil adalah bakteri termofilik yamg berasal daerah sekitar Merapi yang terkena erupsi pada tahun 2010. Penelitian yang sudah dilakukan yaitu mengenai isolasi bakteri termofilik pasca erupsi Merapi tahun 2010 yang diaplikasikan untuk bidang pertanian, yaitu penelitian yang dilakukan oleh peneliti dari LIPI. Kegiatan penelitian oleh LIPI dititikberatkan pada mikroorganisme pelarut fosfat, penambat nitrogen, penghasil hormon tubuh, peningkatan resistensi terhadap penyakit, dan mikroba penghancur senyawa rekalsitran (I Made Sugiana, 2011). Indonesia merupakan negara tropis yang kaya akan sumber daerah dengan suhu tinggi, namun eksplorasi terhadap
bakteri termofilik masih sangat terbatas. Keterbatasan ini pada umumnya disebabkan karena kesulitan untuk mengkultivasi bakteri-bakteri dari lingkungan ekstrem di laboratorium. Informasi mengenai spesies-spesies bakteri yang menghuni suatu lingkungan hidup merupakan informasi penting bagi ilmu biodiversitas dan lebih lanjut akan lebih memudahkan proses isolasi bakteri karena menggunakan media yang sesuai bagi spesies yang dituju. Hasil tersebut diharapkan mampu memberikan sumbangan informasi yang cukup luas dalam bidang biodiversitas mikroba Indonesia serta membuka peluang bagi eksplorasi enzim-enzim termostabil berikutnya. Selain itu kegiatan penelitian kolaboratif juga diharapkan ialah meningkatnya percepatan riset nasional yang tinggi untuk memacu kegiatan penelitian ilmu-ilmu dasar dan lebih lanjut kepada arah produksi enzim berskala industri.

Tujuan penelitian:
1. Mengeksplorasi keanekaragaman bakteri termofilik pasca erupsi Merapi.
2. Mengetahui karakter fenotipik isolat bakteri termofilik pasca erupsi
Merapi.
3. Memperoleh isolat bakteri termofilik yang menghasilkan enzim ekstraseluler amilase, protease, dan selulase.
BAB II KAJIAN PUSTAKA
Termofilik merupakan organisme, terutama mikroorganisme yang mampu beradaptasi tumbuh optimal pada suhu tinggi. Mikroorganisme termofil telah berhasil diisolasi dari habitat terestrial maupun perairan dengan suhu tinggi misalnya daerah gunung berapi dan sumber air panas (Bertoldo and Antranikian,

2002).
Berdasarkan temperatur optimum pertumbuhannya, maka termofilik dapat dijadikan dalam 3 kategori yaitu:

a. Moderate thermophiles dengan temperatur pertumbuhan optimum berkisar antara 35-70 ºC

b. Extreme thermophiles,temperatur pertumbuhan optimum berkisar 55-85 ºC


c. Hyperthermophiles, temperatur pertumbuhan optimum berkisar 75-113 ºC (Baker et al., 2001).

Sedangkan pengelompokan termofil menurut Hughes dan Williams (1977).


1. Obligate thermophiles, temperatur pertumbuhan optimum 65-75 ºC, dan tidak mampu tumbuh dibawah 40 ºC

2. Facultative thermophiles, dapat tumbuh optimal pada temperature 50-60


ºC,dan mampu tumbuh pada 37 ºC
3. Thermotolerant thermophiles, pertumbuhan maksimum pada temperatur 45-
50 ºC, mampu tumbuh pada 30 ºC
Studi ekologis menunjukkan berbagai spesies mikroorganisme dapat eksis dalam lingkungan termofil (Madigan et al., 2009). Extreme thermophiles pada umumnya termasuk Bacillus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Thermus, Thermotoga, dan Aquifex. Hyperthermophiles, termasuk dalam domain Archaea, kingdom Crenarchacota (Sulfolobus, Pyrodictium, Pyrolobus.), dan kingdom Euryarchaeaota (Thermococcus, Pyrococcus ), methanogenes (Methanococcus, Methanobacterium), pereduksi sulfat dan halophiles (Bertoldo and Antrakian,

2002).
Salah satu karakter paling menarik dari termofil adalah kemampuannya dalam memproduksi enzim yang mampu mengkatalis reaksi pada suhu lebih tinggi dibandingkan organisme mesofilik (Demirjian et al., 2001). Properti
stabilitas suhu yang lebih tinggi dan toleransi terhadap bahan kimiawi penyebab denaturasi seperti pelarut organik (Aguilar et al., 1998; Kristjansson, 1989). Kenaikan temperatur dalam proses bioteknologi mempengaruhi ketersediaan dan solubitas senyawa organik seperti poliaromatik, hidrokarbon alifatik, dan substansi polimer. Kenaikan temperatur juga berhubungan dengan penurunan viskositas dan kenaikan koefisien difusi senyawa organik. Hal ini berakibat kecepatan reaksi akan lebih tinggi (Niehaus et al., 1999). Enzim termofil memiliki tingkat kontaminasi yang rendah, kecepatan reaksi lebih baik, dan stabil pada temperatur tinggi (Edward, 1990). Proses-proses biologis ketika dioperasikan dengan suhu diatas 60 ºC akan mengurangi resiko kontaminan oleh organisme lain (Adams and Kelly, 1998). Mikrobia termofil mampu menghasilkan enzim termofil sehingga reaksi enzimatis dapat berjalan lebih cepat, mempercepat difusi, daya larut bahan semakin besar, memperkecil viskositas dan tegangan permukaan media (Hartiko, 1992). Kebanyakan mikrobia mengalami penurunan efektivitas kerja setelah fermentasinya menghasilkan panas, tapi hal ini tidak terjadi pada mikrobia termofil (Edward, 1990).

Kemampuan mikrobia termofilik untuk tumbuh pada temperatur tinggi, disebabkan oleh berbagai faktor misalnya:

a. Memiliki kemampuan mensintesa makromolekul yang stabil terhadap panas. Perbedaan intrinsik struktur makromolekul dan kofaktor stabilisasi termal. Perbedaan struktural pada molekul protein, asam nukleat, lipid, dan enzim. Enzim bakteri termofil ikatannya mempunyai tingkatan asam amino hidrofobik yang lebih tinggi daripada mikrobia mesofilik dan

memiliki ion Mg2+ dengan stabilitas tinggi sehingga struktur ikatannya


lebih erat dan lebih refraktif terhadap panas, tetap aktif, dan tidak alami denaturasi sampai temperatur lebih dari 60 ºC. juga kemampuan mensintesa ribosom yang lebih stabil terhadap panas. Hal ini karena titik cair RNA-nya cukup tinggi, serta keteraturan dari pembungkusnya. Pembungkusnya terdiri atas komposisi dasar G-C dengan jumlah yang lebih banyak dan A-U lebih sedikit (Tansey dan Brock, 1978). DNA termofil juga mempunyai reverse DNA gyrase yang mampu memproduksi
superkoil positif. Perbedaan kenaikan melting point DNA mempengaruhi stabilitas pada temperatur tinggi (Haki and Rakshit, 2003).

b. Kemampuan termostabilitas pada membran sel, karena banyak mengandung lemak jenuh sehingga mikrobia tahan terhadap temperatur tinggi (Ray and Brock, 1971). Termofil memproduksi protein dinamakan chaperonin yang membantu menyusun kembali bentuk awalnya seteleh denaturasi. Komposisi membran sel termofil asam lemak jenuh yang menyediakan linngkungan hidrofob bagi sel. Archaea yang mayoritas hipertermofil mempunyai ikatan ether pada lipid di dinding sel (Haki and Rakshit, 2003).

c. Mensintesa senyawa poliamin unik, seperti thermion dan thermospermin yang menstabilkan perangkat sintesa protein dan melindungi makromolekul terhadap temperatur tinggi (Hartiko, 1992). Termofil memproduksi protein dinamakan chaperonin yang membantu menyusun kembali bentuk awalnya seteleh denaturasi (Haki and Rakshit, 2003).

d. Perubahan komposisi asam amino pada protein menyebabkan peningkatan interaksi elektrostatik, pembentukan ikatan hidrogen dan disulfide, peningkatan interaksi hidrofobik atau kekompakan struktur. Residu sistein lebih sedikit dan hampir tidak ditemukan pada enzim termofil. Inaktivasi sering disebabkan oleh oksidasi grup SH, kandungan sistein yang lebih sedikit dapat memproteksi proses inaktivasi. Lokalisasi residu sistein juga menentukan stabilitas protein. Contoh enzim alkohol dehidrogenase pada Bacillus stearothermophilus mempunyai residu sistein yang sama dengan mesofiliki tetapi grup SH terletak di dalam globula protein sehingga lebih tahan terhadap suhu tinggi (Scandurra et al., 1998; Mozhaev and Martinek,

1984).
e. Substitusi asam amino juga dapat menyebabkan kenaikan hidrofobisitas internal sehingga lebih tahan suhu tinggi. Substitusi dalam enzim termofillik seperti Lys menjadi Arg, Ser menjadi Ala, Ser menjadi Thr dan Val telah dilaporkan oleh Scandurra et al. (1998).

Tabel 1 memperlihatkan berbagai penelitian mengenai bakteri termofil indigen Indonesia sebagai penghasil enzim ekstrasel.


Tabel 1. Bakteri termofil penghasil enzim ekstrasel


No

Sumber isolat

Spesies

Enzim ekstrasel yang dihasilkan

Referensi

1

Berbagai daerah

gunung berapi di

Jawa Barat


Belum diidentifikasi

Kitinase

Rahayu, et al

(1999)


2

Sumber air panas

Danau Ranau

Sumatera Selatan


Bacillus sp

Kitinase

Muharni

(2000)


3

Sumber air panas

Rimbo Panti



Bacillus cereus

Protease

Abdi (2002)

4

Kultur koleksi

Laboratorium Pusat Studi Keragaman Mikrob (RCMD).



Bakteri Gram positif

berbentuk batang, tunggal, serta menghasilkan endospora (belum diketahui nama spesies).



Amilase

Milkha

(2003)


5

Taman Wisata

Padusan Pacet, Kabupaten Mojokerto Jawa Timur



Acetogenium,

Thermus, Thermodesulfobacterium, Thermotrix, Thermomicrobium, Sulfobacillus Pseudomonas. Thermomicrobium Bacillus



Belum diteliti

Ab. Hafiz

(2006)


6

Kultur koleksi

B. stearothermophilus

α-Amilase

Siti S (2010)

7

Sumber air panas Sipoholon Tapanuli Utara

Belum diidentifikasi

Protease

Rosliana

(2011)


8

Sumber air panas

Desa Semangat Gunung, Kab. Karo Sumatera Utara



Belum diidentifikasi

Amilase

Jusuf G

(2011)


9

Sumber air panas

Simalungun

Sumatera Utara


Belum diidentifikasi

Kitinase

Iche, M.D

(2011)



Sampling
BAB III METODE PENELITIAN

Sampel (air dan pasir) dari daerah Gunung Merapi (Kali Gendol Atas) diambil dengan menggunakan teknik purposive random sampling. Sampel ini disimpan di dalam termos untuk menjaga suhu tetap konstan. Temperatur sampel adalah antara 50 º - 60 º C dengan pH 4-7.



Isolasi bakteri termofilik

Isolasi bakteri termofilik dilakukan baik dengan metode dilution plate dan metode enrichment (Holt and Krieg, 1994). Untuk metode enrichment, 10 g sample dipindahkan ke dalam 100 ml media Nutrient Broth (komposisi per liter: yeast ekstrak 2 g; pepton 5 g; NaCl 5g). Air yang digunakan untuk membuat media yaitu air dari Kali Gendol di kawasan Merapi. Dilakukan inkubasi dengan menggunakan rotary shaker pada 55 º C selama 24 jam. kemudian 500 μl dari broth ditanam pada medium Nutrien Agar (komposisi: yeast ekstrak 2 gr; pepton 5 gr; NaCl 5gr, agar 15 g) . Untuk metode dilution plate, 10g pasir dipindahkan ke dalam 90 ml akuades steril (pengenceran 10-1). Hasil pengenceran diambil 1 ml dimasukkan ke 9 ml akuades steril (pengenceran 10-2). Pengenceran dilakukan sampai 10-8. Satu ml dari masing-masing pengenceran tersebut lalu diinokulasi pada medium Nutrien Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada 55 º C. Koloni tunggal lalu reisolasi dengan metode streak plate (Holt and Krieg, 1994).


Karakterisasi koloni
Karakterisasi koloni meliputi warna; bentuk; ukuran; tepi; elevasi
Pertumbuhan pada berbagai temperatur
Isolat ditumbuhkan pada nutrient agar plates dan diinkubasi selama 1-3 hari pada
70 º C. Pertumbuhan diamati secara periodik.
Skrining untuk enzim ekstraseluler
Skrining aktivitas enzim ekstraseluler dilakukan secara kualitatif.
a. Skrining untuk aktivitas protease
Isolat ditumbuhkan pada medium untuk skrining protease (komposisi per liter: Nutrien broth 8 g; skim milk 10 g, agar 15 g). Diinkubasi selama 1-3 hari pada 70

ºC, adanya zona jernih di sekitar koloni menunjukkan adanya aktivitas protease


(Priest et. al. 1988).


b. Skrining untuk aktivitas amilase
Isolat diinokulasi pada media Starch Agar (komposisi per liter: Nutrien broth 8 g; starch 5 g; agar 15 g). Diinkubasi selama 1-3 hari pada 70 ºC, ditambahkan larutan iodine ( I2 =1 g, KI= 2 g/ 300 ml) ke dalam plate, zona jernih dengan latar belakang biru di sekitar koloni menunjukkan adanya aktivitas amilase (Bragger et al., 1989).

c. Skrining untuk aktivitas selulase
Isolai murni diinokulasi pada media selulolitik Mandels-CMC (komposisi: KH2PO4 0,05% (b/v); K2SO4 0,05%; (NH4)2SO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,01%; CaCl2 0,1%, dan NaCl 0,6%; sebagai sumber karbon digunakan Carboxy Methyl Cellulosa (CMC) 0,5%; yeast ekstrak 0,01%; agar 2%) (Basuki, 1995). Kemudian diinkubasi selama 3-4 hari pada 70 ºC, ditetesi larutan 0,1 % congo red atau larutan iod. Setelah diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Zona jernih di sekitar koloni menunjukkan adanya aktivitas selulase (Bragger et al., 1989).
Erupsi Gunung Merapi tahun 2010


Dampak positif : penemuan organisme dengan karakteristik

khas misalnya tahan suhu dan kadar

sulfur tinggi
Dampak negatif: kerugian material dan imaterial termasuk kerusakan lingkungan dan keanekaragaman hayati



Mikroorganisme indigen Indonesia yang berpotensi

Bakteri termofil berpotensi penghasil enzim ektraseluler yang berguna untuk bidang industri



Alternatif mengatasi hambatan di bidang industri melalui penemuan bakteri yang berpotensi


Enzim termostabil dan termoaktivitas tinggi

Gambar 1. Kerangka berfikir penelitian


Kekayaan plasma nutfah Indonesia yang berupa bakteri indigen berpotensi sebagai penghasil enzim amilase, protease, dan selulase serta mengurangi biaya industri
Kerangka berfikir penelitian


BAB IV

HASIL dan PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian
A. 1. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri

Penelitian diawali dengan kegiatan survey lokasi di sekitar kawasan Gunung Merapi. Hasil survey tanggal 18 Mei 2011 menunjukkan daerah yang masih bersuhu tinggi (kisaran lebih dari 50 ⁰C) yaitu Kali Gendol Atas, sedangkan suhu daerah lain pasca erupsi Merapi sudah normal kembali (kisaran 20-30 ⁰C). Kemudian dilakukan tahap pengambilan sampel yang telah dilaksanakan pada hari Sabtu, 21 Mei 2011 pada jam 10.00-12.00 WIB. Sampel diperoleh dari Kali Gendol Atas kawasan Gunung Merapi berupa 9 sampel pasir dan 3 sampel air. Pengambilan sampel dibedakan daerah atas, tengah, dan bawah berdasarkan letak dari sumber mata air Kali Gendol Atas. Gambar 1 dan 2 menunjukkan lokasi




pengambilan sampel.







Gambar 1. Lokasi pengambilan sampel

Kali Gendol Atas



Gambar 2. Aliran Kali Gendol Atas

Pada saat pengambilan sampel dilakukan pengukuran data abiotik meliputi pH dan suhu. Tabel 2 memperlihatkan data abiotik pH dan suhu sampel. pH pasir lebih rendah (4,2-5,4) dibandingkan pH air (6,2-7,2). Sedangkan suhu sampel air lebih tinggi (42-47) ⁰C dibandingkan pasir (54-60) ⁰C.


Tabel 2. Data abiotik pengambilan sampel


No

Sampel

Lokasi

pH

Suhu (⁰C)

1

Pasir

Atas A

4,8

47

2

Atas B

4,8

47

3

Atas C

4,8

47

4

Tengah A

5,4

44

5

Tengah B

5,4

44

6

Tengah C

5,4

44

7

Bawah A

4,2

42

8

Bawah B

4,2

42

9

Bawah C

4,2

42

10

Air

Atas

6,2

60

11

Tengah

7,2

57

12

Bawah

7,2

54

Isolasi bakteri dari sampel dilakukan pada hari Sabtu 21 Mei 2011 dengan


2 metode yaitu dilution dan enrichment. Inkubasi dilakukan pada suhu 55 ⁰C. Pengamatan pertumbuhan bakteri setelah 48, 72, dan 96 jam . Hasil pengamatan pertumbuhan koloni bakteri dari sampel air dan pasir dengan metode dilution (lampiran 2) dan metode enrichment (lampiran 3). Tabel 3 menunjukkan hasil reisolasi koloni yang tumbuh pada media NA plate suhu inkubasi 55⁰C diperoleh

98 isolat, setelah diseleksi pada suhu 70 ⁰C diperoleh 34 isolat.
Tabel 3. Jumlah isolat kultur murni hasil reisolasi pada suhu inkubasi 55 ⁰ C dan


Metode

Sumber

Suhu inkubasi (⁰C)

55

70

Dilution

Air atas

2

2

Air tengah

26

8

Air bawah

12

5

Pasir atas

4

1

Pasir tengah

37

11

Pasir bawah

17

7

Jumlah

98

34

Enrichment

Air atas

100

71

Air tengah

43

42

Air bawah

78

60

Pasir atas

43

15

Pasir tengah

48

18

Pasir bawah

70

13

Jumlah

382

219



70 ⁰ C selama 72 jam
Metode lain isolasi yaitu dengan metode enrichment diperoleh 382 isolat dari sampel air dan pasir yang mampu tumbuh pada suhu inkubasi 55⁰C. sedangkan setelah diseleksi diperoleh 219 isolat yang mampu tumbuh dengan suhu inkubasi 70 ⁰C. Tabel 4 menunjukkan jumlah isolat yang berhasil diisolasi dari sampel air dan pasir Kali Gendol Atas. Isolat yang diperoleh dengan metode

enrichment jumlahnya lebih banyak dibandingkan dengan metode dilution.



Gambar 3. Grafik jumlah isolat hasil isolasi dengan metode dilution



Gambar 4. Grafik jumlah isolat hasil isolasi dengan metode dilution

Gambar 3 dan 4 memperlihatkan hasil seleksi pertumbuhan isolat yang telah diperoleh. Seleksi yang telah dilakukan yaitu menginkubasinya pada suhu lebih tinggi yaitu 70⁰C. Hasil seleksi menunjukkan tidak semua isolat mampu tumbuh pada suhu lebih tinggi. Isolat yang mampu tumbuh pada suhu 70⁰C yaitu dari metode dilution sebanyak 34 isolat. Sedangkan dari metode enrichment sebanyak 217 isolat.



Gambar 5. Grafik karakter koloni isolat hasil isolasi dengan metode dilution
Karakterisasi fenotipik yang dilakukan yaitu pengamatan karakter morfologi koloni meliputi warna, bentuk, ukuran, tepi, dan elevasi koloni. Gambar 5 memperlihatkan keanekaragaman karakter koloni bakteri termofil yang mampu tumbuh pada inkubasi 70⁰C selama 72 jam. Warna koloni didominasi oleh warna putih susu (30 isolat) sedangkan warna kuning (3 isolat) dan hitam (1 isolat). Bentuk koloni ditemukan ada 2 yaitu sirkuler (19 isolat) dan irreguler (15 isolat). Ukuran koloni bervariasi dari pinpoint (12 isolat), kecil (14 isolat), sedang (4 isolat), dan besar (4 isolat). Tepi koloni didominasi entire (23 isolat), sedangkan undulate (8 isolat) dan lobate (3 isolat). Elevasi rata (flat) mendominasi

sebanyak isolat 33 isolat sedangkan raised hanya 1 isolat.



Gambar 6. Grafik karakter koloni isolat hasil isolasi dengan metode enrichment
Gambar 6 memperlihatkan keanekaragaman karakter koloni bakteri termofil hasil isolasi dengan metode enrichment yang mampu tumbuh pada inkubasi 70⁰C selama 72 jam. Warna koloni didominasi oleh warna putih susu (193 isolat) sedangkan warna merah (19 isolat) dan kuning (7 isolat). Bentuk koloni sirkuler (128 isolat) lebih banyak dari irreguler (91 isolat). Ukuran koloni bervariasi dari
pinpoint (79 isolat), kecil (105 isolat), sedang (27 isolat), dan besar (8 isolat). Tepi koloni didominasi entire (158 isolat), sedangkan undulate (61 isolat). Elevasi rata (flat) mendominasi sebanyak isolat 219 isolat sedangkan raised hanya 1 isolat.

A. 2. Uji aktivitas enzim ekstraseluler
Kemampuan memproduksi enzim ekstrasel dilakukan uji terhadap 253 isolat yang mampu tumbuh pada suhu 70⁰C. Enzim ekstrasel yang diuji yaitu enzim amilase, protease, dan selulase. Pengujian aktivitas enzim amilase dilakukan dengan media Starch Agar, enzim protease dengan media skim milk, dan enzim selulase menggunakan media Mandels-CMC. Hasil pengujian menunjukkan tidak semua isolat memproduksi ke-3 enzim tersebut. Gambar 7 memperlihatkan grafik jumlah isolat yang mampu menghasilkan enzim ekstraseluler amilase, protease, dan selulase. Isolat yang berpotensi memproduksi enzim amilase sebanyak 9 isolat yaitu isolat D2, D91, D92, D93, D113, D132, D134, D138, dan D140. Isolat yang memproduksi enzim protease sebanyak 4 isolat yaitu D90, D91, D93, dan E371. Sedangkan satu isolat yaitu D2 memperlihatkan kemampuan memproduksi enzim selulase. Isolat yang menunjukkan aktivitas enzim ekstraseluler didominasi dari hasil isolasi dengan metode dilution sebanyak 10 isolat sedangkan dari metode enrichment hanya 1

isolat.



Gambar 7. Grafik jumlah isolat yang menunjukkan aktivitas enzim ekstraseluler
Tabel 4. Grup enzim, jumlah, dan nomor isolat


Grup enzim

Jumlah

Isolat

Amilase

6

D92, D113, D132, D134, D138, D140

Protease

2

D90, E371

Amilase, Selulase

1

D2

Amilase, protease

2

D91, D93

Tabel 4 memperlihatkan adanya isolat yang menunjukkan aktivitas hanya


1 macam enzim maupun 2 enzim. Aktivitas hanya enzim amilase (grup amilase) sebanyak 6 isolat dan hanya enzim protease 2 isolat. Sedangkan 1 isolat menunjukkan aktivitas enzim amilase dan selulase. Dua isolat menunjukkan grup enzim amilase dan protease.

Isolat-isolat yang diperoleh tidak semuanya positif menunjukkan aktivitas enzim ekstrasel ditandai dengan terbentuknya zona jernih pada medium uji Starch Agar, skim milk, dan mandels-CMC. Tetapi beberapa isolat menunjukkan pertumbuhan pada medium uji. Lampiran 4 menunjukkan pengamatan pertumbuhan dan zona jernih pada medium uji. Tabel 5 menunjukkan perbedaan jumlah isolat yang mampu tumbuh pada medium uji.

Tabel 5. Hasil pengamatan pertumbuhan isolat pada medium uji dengan suhu 70 ⁰

C selama 48 jam


Pengamatan

Media

Starch Agar

Skim Milk

Mandels-CMC

Zona jernih

9

4

1

Tumbuh, tidak menunjukkan zona

jernih


224

38

11

Tidak ada pertumbuhan

20

211

241


Gambar 8. Grafik pertumbuhan isolat pada media uji


Gambar 8 memperlihatkan isolat yang mampu tumbuh dan menunjukkan aktivitas enzimatik terbanyak pada media uji Starch Agar, kemudian media skim milk dan yang tumbuh paling sedikit pada media uji Mandels-CMC. Hal ini mengindikasikan isolat yang menghasilkan enzim amilase lebih banyak dibandingkan enzim protease dan selulase.


Gambar 9. Grafik nisbah zona jernih/koloni
Uji aktivitas enzim ekstraseluler amilase, protease, dan selulase ditandai dengan adanya nisbah zona jernih/koloni yang ditunjukkan Gambar 9. Isolat sebanyak 9 menunjukkan aktivitas enzim amilase. Nisbah tertinggi pada aktivitas enzim amilase oleh isolat D93 (4,883) sedangkan terendah D140 (1,908). Aktivitas protease pada 3 isolat dengan nisbah tertinggi D90 (2,952) dan terendah D91 (1,328). Aktivitas selulase hanya ditunjukkan oleh 1 isolat yaitu D2 dengan nisbah 1,897.
B.Pembahasan
B.1. Isolasi dan karakterisasi
Isolasi bakteri termofil pasca erupsi Merapi dilakukan di Kali Gendol Atas karena merupakan daerah dengan suhu lingkungan berkisar 50 ⁰C. Pengukuran data abiotik juga dilakukan untuk mengetahui karakter habitat awal bakteri tersebut. Gorlach-Lira dan Coutinho (2007: 135 ) menyatakan bahwa keberadaan bakteri di alam sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor fisik dan khemis termasuk ketersediaan nutrien, bahan organik, kelembaban, dan temperatur.

Pengukuran kondisi abiotik menunjukkan pH pasir lebih rendah (4,2-5,4) dibandingkan pH air (6,2-7,2). Sedangkan suhu sampel air lebih tinggi (42-47) ⁰C dibandingkan pasir (54-60) ⁰C. Suhu sampel memperlihatkan penurunan berkaitan dengan semakin jauh letaknya dari sumber mata air. Hasil penelitian Suriadikarta dkk (2011: 1) menunjukkan hasil analisis pH tanah dan abu volkan rata-rata > 5 dan mengandung unsur hara makro K dan makro sekunder seperti Ca dan Mg. Kemasaman air sekitar bencana berkisar antara 5,1-7,3; pH tersebut merupakan pH yang optimum bagi pertumbuhan tanaman.

Isolasi dilakukan dengan 2 metode yaitu dilution dan enrichment. Perbedaan metode ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri sebanyak mungkin. Hasil penelitian menunjukkan jumlah isolat yang didapat dengan metode enrichment lebih banyak dibandingkan dengan metode dilution. Hal ini disebabkan metode enrichment merupakan metode pengkayaan yang mendukung pertumbuhan mikroorganisme yang dikehendaki. Media untuk isolasi yaitu Nutrien Cair yang dibuat menggunakan air dari Kali Gendol Atas kemudian dishaker dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 55 ⁰C. Pembuatan media untuk enrichment menggunakan air langsung dari Kali Gendol Atas dengan tujuan memperkaya kandungan senyawa yang terdapat didalamnya. Hasil penelitian Suriadikarta (2011: 1) menunjukkan terjadi penurunan keragaman dan populasi mikroba tanah terutama pada tanah lapisan atas, sedangkan keragaman dan populasi mikrobapada tanah lapisan bawah tidak terpengaruh.

Tahap selanjutnya yaitu skrining isolat bakteri pada suhu inkubasi untuk mendapatkan isolat bakteri termofil yang mampu tumbuh pada suhu 70 ⁰C. Jumlah isolat yang mampu tumbuh pada suhu 70 ⁰C lebih sedikit dibandingkan


dengan suhu 55 ⁰C. Hal ini disebabkan tidak semua bakteri mampu beradaptasi dan hidup pada suhu lebih tinggi dari keadaan normalnya. Kisaran suhu pada habitat awalnya yaitu 42-60 ⁰C. Kemampuan tumbuh pada suhu lebih tinggi perlu didukung faktor morfologis dan fisiologis isolat bakteri. Garlach-Lira & Coutinho (2007: 140) menyatakan populasi lokal bakteri diseleksi oleh kapasitas fisik seperti suhu dan kekeringan dengan adanya karakteristik morfologi dan fisiologis seperti produksi enzim tertentu yang merupakan salah satu faktor penting di lingkungan ketika ketersediaan nutrien terbatas.

Pengambilan sampel dilakukan pada air dan pasir dengan kedalaman ± 20 cm yang masih memungkinkan terjadinya aerasi. Hal ini mempengaruhi keberadaan bakteri yang berhasil diisolasi. Semua isolat bakteri tumbuh pada permukaan media nutrien agar plate yang merupakan indikasi awal bakteri bersifat aerob.

Tahap selanjutnya yang dilakukan adalah karakterisasi isolat bakteri. Karakterisasi merupakan tahap awal untuk identifikasi. Karakter fenotipik isolat bakteri yang mudah diamati adalah morfologi koloni. Hasil pengamatan morfologi koloni pada media Nutrien Agar plate menunjukkan perbedaan bentuk, warna, ukuran, tepi, dan elevasi koloni isolat bakteri. Perbedaan cultural characteristic ini merupakan salah satu indikator awal keanekaragaman bakteri termofil yang berhasil diisolasi. Walaupun untuk penentuan sampai tingkat spesies masih perlu dilakukan tahap uji fisiologis dan molekuler.

B.2. Uji aktivitas enzim ekstraseluler
Jumlah isolat bakteri termofil yang menunjukkan uji aktivitas enzim ekstrasel positif baik untuk amilase, protease, maupun selulase masih sedikit. Salah satu faktor yang berpengaruh adalah suhu yang mencapai 70 ⁰C. Produksi dan aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu. Babu dan Stanaryana (1995) serta Lealem dan Gashe(1994) dalam Ashraf et al (2005: 65) melaporkan suhu 50 ⁰C merupakan suhu terbaik untuk produksi amilase termostabil. Sedangkan aktivitas enzim amilase kasar maksimum 65 ⁰C sedangkan amilase akan kehilangan 50% aktivitasnya pada suhu 70 ⁰C. Sedangkan Girinda (1993) dalam Merryandini dkk (2009: 34) menyatakan ketika suhu bertambah sampai suhu optimum,kecepatan reaksi enzim naik karena energi kinetik bertambah. Bertambahnya energi kinetik
akan mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi baik enzim maupun substrat. Hal ini akan memperbesarpeluang enzim dan substrat bereaksi. Ketika suhu lebih tinggi dari suhu optimum, protein berubah konformasi sehingga gugus reaktif terhambat. Perubahan konformasi ini dapat menyebabkan enzim terdenaturasi. Substrat juga dapat berubah konformasinya pada suhu yang tidak sesuai, sehingga substrat tidak dapat masuk ke dalam sisi aktif enzim.

Beberapa isolat mampu menghasilkan enzim ekstrasel ketika ditumbuhkan pada media uji starch agar, skim milk, dan Mandels-CMC. Hal ini dikarenakan enzim amilase, protease, dan selulase merupakan inducible enzim yang akan diproduksi ketika terdapat amilum (starch), protein (casein dalam skim milk), dan selulosa (CMC/Carboxy Methyl Cellulosa) dalam substrat. Alamri (2010: 544) menyatakan induksi α-amylase membutuhkan substrat yang memiliki ikatan α-1,4 glukosida termasuk starch dan maltosa.

Uji aktivitas enzim selulase hanya mendapatkan 1 isolat yang positif menghasilkan zona jernih. Kazue et al (2006) dalam Ibrahim & El-Diwany (2007:

477) isolat bakteri dari sumber air panas yang mampu memproduksi selulase jumlahnya sedikit. Hal ini berkaitan dengan kandungan bahan organik dalam sampel dan pentingnya tahap enrichment untuk isolasi enzim penghidrolisis polisakarida.

Faktor lain yang mempengaruhi kecepatan biodegradasi selulosa dipengaruhi oleh faktor lingkungan yaitu:

1. Jumlah nitrogen tersedia. Kecepatan degradasi sebanding dengan konsentrasi nitrogen yang ditambahkan dan sebagai sumber nitrogen dapat ditambahkan amonium, nitrat, urea, asam amino, dan kasein.

2. Suhu.degradasi selulosa dapat berlangsung pada suhu 5-65 C. mikrobia mesofilik aktif pada suhu 25-37 C sedangkan thermofilik pada suhu >

45 C .
3. Aerasi. Mikroba aerob dominan pada keadaan cukup oksigen sedangkan anaerob dominan pada keadaan kurang oksigen

4. pH. Degradasi pada keadaan asam terutama oleh fungi sedangkan netral sampai alkali banyak mikroba aktif terutama bakteri dan aktinomisetes
5. Sumber karbohidrat lain. Pertumbuhan mikrobia lebih baik pada tanaman yang mengandung selulosa campuran daripada selulosa murni

6. Kandungan lignin pada residu. Kandungan lignin makn tinggi maka peromabakan selulosa akan makin lambat. Selulosa dan lignin membentuk struktur saling menutup yang erat (Kabirun, 1990: 2)

Kemampuan tumbuh pada media Mandels-CMC merupakan indikasi awal bahwa isolat bakteri tersebut dapat menggunakan selulosa. Akan tetapi belum sampai terbentuk zona jernih karena proses degradasi belum sampai tahap glukosa. Enzim selulase merupakan sistem enzim yang terdiri dari beberapa enzim berbeda. Tipe enzim yang dikenal sebagai sistem selulase adalah: endoglucanases (endo-1,4-ß-glucanases, atau 1,4-ß-D-glucan 4- glucanohydrolases, EC 3.2.1.4), cellobiohydrolases (exo-1,4-ß-glucanases, or 1,4- ß-D-glucan cellobiohydrolases, EC 3.2.1.91) and cellobiases (ß-glucosidases, or ß-D-glucoside glucohydrolases, EC 3.2.1.21).

Menurut Lynd et al (2002: 511) mekanisme selulolitik melibatkan 3
reaksi:
1. Endoglucanase memotong secara random sisi amorf internal rantai polisakarida menjadi oligosakarida dengan panjang bervariasi

2. Exoglucanase beraksi pada rantai akhir reduksi atau nonreduksi menjadi glukosa atau selobiosa dan dapat beraksi juga pada selulosa mikrokristal

3. β-glucosidase menghidrolisis allodekstrin terlarut dan selobiosa menjadi glukosa


Kesimpulan
BAB V KESIMPULAN dan SARAN

1. Bakteri termofilik pasca erupsi Merapi yang berhasil diisolasi dari sampel air dan pasir Kali Gendol Atas dengan suhu inkubasi 55⁰C diperoleh 480 isolat, setelah diseleksi pada suhu 70 ⁰C diperoleh 253 isolat.

2. Karakter fenotipik isolat bakteri termofilik pasca erupsi Merapi
menunjukkan keanekaragaman morfologi meliputi warna, bentuk, ukuran, tepi, dan elevasi koloni.

3. Isolat bakteri termofilik yang menghasilkan enzim ekstraseluler amilase sebanyak 9 isolat, enzim protease sebanyak 4 isolat, dan 1 isolat penghasil

enzim selulase pada suhu inkubasi 70 ⁰C.
Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lanjut mengenai kemampuan isolat bakteri termofil dalam menghasilkan enzim-enzim lain.

2. Optimasi produksi enzim dan pengaruh faktor-faktor lain dalam produksi enzim amilase, protease, dan selulase.

3. Karakterisasi fenotipik dan genotipik bakteri yang berhasil diisolasi sehingga dapat diketahui nama spesies dan hubungan kekerabatannya.



DAFTAR PUSTAKA
Abdi D & Busman. 2002. Amobilisasi Sel Bakteri Bacillus cereus Termofilik untuk Penghasil Protease. Jurnal Kimia Andalas. 8(2): 57-61.
Abd. Hafid Asnawi. 2006. Keanekaragaman Bakteri Termofilik yang Terdapat Dalam Sumber Air Panas di Taman Wisata Padusan Pacet, Kabupaten Mojokerto, Jawa Timur. Skripsi. FMIPA Universitas Negeri Malang.
Adams, M.W.W. and Kelly, R.M. 1998. Finding and Using Hyperthermophilic

Enzymes,.TIBTECH 16: 329-332.


Aguilar, A., Ingemansson, T., Magnien, E. 1998. Extremophile Microorganisms as Cell Factories : Support From The European Union, . Extremophiles 2,

367-373.
Alamri. S.A. 2010. Isolation, Phylogeny and Characterization of New α-

amylase Producing Thermophilic Bacillus sp. From the Jazan Region, Saudi Arabia. International Journal of Biotechnology and Biochemistry Volume 6 Number 4 (2010) pp. 537–547
Ashraf, H., K. Rana, H. Zainab, and I. Ulhaq. 2005. Production of Alpha Amilase by A Thermophilic Strain Bacillus licheniformis. Journal of Food Technology 3(1): 64-67
Baker, G., Gaffar, S., Cowan, D. A., Suharto A. R. 2001. Bacterial Community

Analysis of Indonesian Hotsprings,. FEMS Microbiology Letters 200, 103-

109.
Bertoldo C. and Antranikian G. 2002 .Starch-Hydrolyzing Enzymes from

Thermophilic Archea And Bacteria,.Current Opinion İn Chemical Biology



6: 151-160.
Bragger, J.M., Daniel, R.M., Coolbear, T., Morgan, H.W. 1989. Very stable enzymes from extremely thermophilic archaebacteria and eubacteria,. Applied Microbiology and Biotechnology 31,556-561.
Demirjian, D., Moris Varas, F., Cassidy, C.S. 2001. Enzymes from

Extremophiles, Current Opinion in Chemical Biology 5, 144-151.


Edwards, C. 1990. Thermophiles in Microbiology of Extreme Environment. Ed 5.

Clive Edwardas. Mc Graw Hill Publ. Comp. New York: 23


Gorlach-Lira, K and H.D.M Coutinho. 2007. Population dynamics and extracelular enzymes activity of mesophilic and thermophilic bacteria isolated from semi-arid soil of northeastren Brazil. Brazilian Journal of Microbiology (2007) 38:135-141
Haba, E., Bresco, O., Ferrer, C., Marques, A., Basquets, M., Manresa, A.

2000.Isolation of Lipase Secreting Bacteria by Deploying Used Frying Oil

As Selective Substrate . Enzyme And Microbial Technology 26, 40-44.
Haki, G.D. and Rakshit, S.K. 2003. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89: 17-34.
Hartiko, H. 1992. Biologi Mikroorganisme Termofil. Pusat Antar Universitas- Biotek. Universitas Gadjah Mada, 25-30.
Holt, J.G. and Krieg, N.R. . 1994. Enrichment and Isolation . in Methods for General and Molecular Bacteriology, edited by P. Gerhardt (ASM Publications,), pp. 197-200
Huges R.A.P and Williams R.A.D..Yelow-pigmented Strains of Thermus ssp.

1977. From Icelandic Hot Springs, Journal of General Microbiology 102,

375-383.
Ibrahim A.S.S and Al Dewany. 2007. Isolation and Identification of New Cellulases Producing Thermophilic Bacteria from an Egyptian Hot Spring and Some Properties of the Crude Enzyme. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 1(4): 473-478
Iche, M.D. 2011. Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Kitinase Termofilik Kasar Dari Sumber Air Panas Tinggi Raja, Simalungun Sumatera Utara. http://www.researchgate.net. Tanggal 28 Februari 2011

I Made Sudiana. 2011. Mikroba untuk Pemulihan Pertanian Merapi. Kompas. 11

Februari 2011
Jusuf, G. 2011. Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik Dari Sumber Air Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara. http://www.researchgate.net. Tanggal 28 Februari 2011.

Kabirun. 1990. Biodegradasi limbah berselulosa: kursus singkat ekologi mikrobia. PAU Bioteknologi UGM. Yogyakarta


Kobayashi, T., Hatada, Y., Higaki, N., Lusterio, D. D., Ozawa, T., Koike, K., Kawai, S., Ito, S., 1999.Enzymatic properties and deduced amino acid sequence of a high alkaline pectate lyase from an alkaliphilic Bacillus isolate,. Biochimica et Biophysica Acta 1427: 145-154.
Kristjansson, J.K. 1989 .Thermophilic Organisms as Sources of Thermostable

Enzymes,.TIBTECH 7: 349-353.


Lynd L.R., J.W. Paul, H.V.Willem, and S.P. Isak. 2002. Microbial cellulase utilization Fundamental & Biotech. Microbial and Mol. Biology. 66(3):

506-577
Madigan, M.T., J.M. Martinko, and J.Parker. 2009. Brock Biology of



Microorganisms. 12th ed. Prentice Hall International. Inc. USA
Meryandini, A, Wahyu W, Besty M., Titi C.S.,Nisa R, dan Hasrul S. 2009.

Isolasi Bakteri Selulolitik dan Karakterisasi Enzimnya. Makara, Sains.



VOL. 13, NO. 1: 33-38
Milkha, M. 2003. Penapisan dan Karakterisasi Sejumlah Isolat Bakteri Termofilik

Amilolitik. http://repository.ipb.Ac.id. tanggal 28 Februari 2011


Mozhaev, V. V. and Martinek, K.1984 .Structure .Stability Relationships In Proteins : New Approaches to Stabilizing Enzymes, Enzyme Microbial Technology 6: 50-57
Muharni. 2000. Isolasi dan identifikasi bakteri penghasil kitinase dari Sumber Air

Panas Danau Ranau Sumatera Selatan. Jurnal Penelitian Sains, 9: 12-15.


Niehaus, F., Bertoldo, C., Kahler, M., Antranikian, G. 1999. Extremophiles as a Source of Novel Enzymes For Industrial Application,. Applied Microbial Biotechnology 51: 711-729.
Priest, G. F., Goodfellow, M., Todd, C.. 1988. A Numerical Classification of the genus Bacillus, .Journal Of General Microbiology 134, 1847-1882.
Rahayu S. 1999. Eksplorasi Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Kitinase Asal Indonesia. Prosiding Seminar Hasil-hasil Penelitian Bidang Ilmu Hayat. Bogor : IPB. p. 349 – 356
Rosliana, P. 2011. Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Protease Termofilik Dari Sumber Air Panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara. http://www.researchgate.net. Tanggal 28 Februari 2011.

Scandurra, R., Consalvi, V., Chiaraluce, R., Politi, L., Engel, P. C. 1998. Protein Thermostability In Extremophiles,. Societe Française de Biochime et Biologie Moleculaire 80: 933-941.


Siti, S. 2010. Isolasi enzim α-Amilase termostabil dari dari bakteri termofil

Bacillus stearothermophilus. Skripsi. ITS.
Suriadikarta, D.A., Abdullah Abbas Id., Sutono, Dedi Erfandi, Edi Santoso, dan A. Kasno. 2011. Identifikasi Sifat Kimia Abu Volkan, Tanah dan Air di Lokasi Dampak Letusan Gunung Merapi.Balai Penelitian Tanah,Bogor
Tansey, M.B and T.D.Brock. 1978. Microbial life at high temperatures ecological

Aspects, Academic Press. San Fransisco (12): 28-33
Tortora, G.J., B.R. Funke, and C.L. Case. 2007. Microbiology an introduction, 9th ed. Benjamin Cummings, USA
lAPORAN PENELITIAN KELOMPOK KAJIAN TAHUN ANGGARAN 2011

EKSPLORASI BAKTERI TERMOFILIK PASCA ERUPSI MERAPI SEBAGAI PENGHASIL ENZIM EKSTRASELULER

Oleh :

Anna Rakhmawati, M.Si

Evy Yulianti, M.Sc

Dibiayai oleh DIPA-UNY sesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Hibah

Penelitian Nomor: 4/H34.21/KTR.KK/2011

PUSAT STUDI LINGKUNGAN HIDUP LEMBAGA PENELITIAN



UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA TAHUN 2011








Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©anasahife.org 2016
rəhbərliyinə müraciət